Notre méthode est l’une des premières à pouvoir disséquer les bases génétiques des différences de caractères à l’échelle du génome entre les espèces plutôt qu’au sein des espèces. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est à haut débit, haute résolution, et largement applicable. Pour commencer cette procédure, récupérez la souche du stock de congélation JR507 de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius, et stries jusqu’à des colonies simples sur une plaque d’agar YPD.
Incuber à 26 degrés Celsius pendant deux jours ou jusqu’à ce que les colonies apparaissent. Puis inoculer 100 millilitres de YPD liquide dans un flacon de verre de 250 millilitres avec une seule colonie de JR507, et incuber à 28 degrés Celsius tout en secouant à 200 RPM pendant 24 heures ou jusqu’à ce que la phase stationnaire est atteint. Le lendemain, mesurez l’od600 de la culture du jour au lendemain.
Retour diluer une partie de la culture du jour au lendemain avec ypd liquide frais dans un nouveau flacon d’un litre pour créer une nouvelle culture avec un od600 de zéro point deux et un volume de 500 millilitres. Répétez ce processus trois fois de plus pour créer un total de quatre cultures avec un od600 de zéro point deux, en utilisant la même culture du jour au lendemain pour toutes les nouvelles cultures. Incuber toutes les cultures à 28 degrés Celsius pendant six heures tout en secouant à 200 RPM.
Après cela, combinez deux des cultures de 500 millilitres pour créer une culture d’un litre. Combinez les deux autres cultures de 500 millilitres pour créer une deuxième culture d’un litre. Tout d’abord, diviser chacune des cultures d’un litre en 20 aliquots de 50 millilitres chacun dans un tube conique en plastique pour un total de 40 tubes.
Réserver 20 tubes. Centrifugeuse les 20 tubes restants à 1000 fois G pendant trois minutes pour pelleter les cellules de levure. Jetez le supernatant et réutilisez chaque granulé avec 25 millilitres d’eau stérile par vortex.
Centrifugeuse à 1000 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant, et résuspendez chaque granulé avec cinq millilitres de 1X Tris-EDTA zéro point un tampon molaire d’acétate de lithium par vortex. Centrifugeuse à 1000 fois G pendant trois minutes.
Jetez le supernatant, et résuspendez chaque granulé à nouveau avec cinq millilitres 1X Tris-EDTA zéro point un tampon molaire d’acétate de lithium par vortex. Centrifugeuse à 1000 fois G pendant trois minutes. Pendant que les cellules centrifugent, préparez au moins 120 millilitres d’une solution contenant du polyéthylène glycol, de l’acétate de lithium et du tampon Tris-EDTA.
Conservez cette solution sur la glace. Pour préparer l’ADN plasmatique à la transformation, faire bouillir d’abord quatre millilitres d’ADN de sperme de saumon à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, refroidissez-le immédiatement sur la glace pendant cinq minutes.
Mélanger 20 millilitres de pJR487 à une concentration de 538 nanogrammes par millilitre avec quatre millilitres de l’ADN du sperme de saumon froid. Garder ce mélange sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Ensuite, ajoutez 600 microlitres du mélange d’ADN de plasma et de sperme sur chaque granule cellulaire.
Ajouter trois millilitres du mélange PEG d’acétate de lithium TE à chaque granulé. Nous suspendons par pipetting de haut en bas, puis vortexing. Incuber les tubes à température ambiante pendant 10 minutes.
Puis la chaleur choque chaque tube dans un bain d’eau à 39 degrés Celsius pendant 26 minutes, en s’assurant d’inverser chaque tube toutes les quelques minutes. Centrifuger les tubes à 1000 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et réutilisez chaque granulé dans 10 millilitres de YPD par vortex.
Après cela, mélanger les 20 tubes dans un nouveau flacon de verre. Ajouter 433 points quatre millilitres de liquide YPD dans un nouveau flacon de verre d’un litre. Puis transférer 66 points six millilitres de cellules dans le flacon.
Répétez ce processus de transfert deux fois de plus pour utiliser tout le volume des cellules transformées. Ensuite, mesurez l’od600 de chaque nouvelle culture de 500 millilitres. Incuber les trois cultures à 28 degrés Celsius pendant deux heures tout en secouant à 200 RPM.
Après cela ajouter zéro point cinq millilitres de 300 milligrammes par microlitre G418 à chacun des flacons à une concentration finale de 300 microgrammes par millilitre. Remettre les flacons dans l’incubateur qui tremble à 28 degrés Celsius et 200 rPM. Répétez tout ce processus avec les 20 tubes coniques restants.
À ce stade, il devrait y avoir six flacons d’un litre, chacun contenant 500 millilitres de cellules avec G418 ajouté. Incuber les six flacons à 28 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant environ deux jours ou jusqu’à ce qu’un od600 d’environ deux points trois soit atteint dans chaque flacon. Ensuite, combinez les six flacons ensemble pour créer une culture unique.
Utilisez cette culture combinée pour inoculer deux nouveaux flacons d’un litre avec 500 millilitres de YPD et G418 à un od600 de zéro point deux. Incuber ces nouvelles cultures du jour au lendemain à 28 degrés Celsius avec des secousses à 200 RPM jusqu’à ce qu’il atteigne un od600 d’environ deux points deux. Après cela, combiner les deux cultures en une seule culture, et mesurer l’od600 de la culture combinée.
Centrifugeuse 25 millilitres de cette culture à 1000 fois G pendant trois minutes. Calculez le nombre total d’unités od600 de cellules qui se trouvent dans les 25 millilitres décrites dans le protocole texte. Jeter le supernatant, et resuspendre les cellules dans suffisamment d’eau pour créer une suspension cellulaire avec un od600 d’un point huit cinq par millilitre.
À l’aide de perles de verre, plaquez un millilitre de cellules résuspendues sur chacune des 12 grandes plaques carrées complètes d’agar synthétique avec 5-FOA. Incuber chaque assiette à 28 degrés Celsius pendant un à deux jours, ou jusqu’à ce qu’une pelouse se forme sur l’assiette. Ensuite, utilisez de petits grincements stériles pour gratter les cellules de la moitié de la plaque, et dans un tube, contenant 35 millilitres d’eau stérile.
Répétez ce processus pour les six plaques restantes, ce qui entraîne deux tubes de cellules dans l’eau. Combinez les suspensions cellulaires en un seul flacon et mesurez l’od600 de la suspension, en utilisant l’eau comme blanc. Utilisez de l’eau pour ajuster la concentration cellulaire jusqu’à ce que l’od600 atteigne 44 points quatre par millilitre.
Ensuite, préparez des stocks de cellules au congélateur et stockez-les à moins 80 degrés Celsius, comme le prévoit le protocole texte. Dans cette étude, S.Cerevisiae et S.Paradoxus sont acoupillés pour former un hybride stérile, qui est soumis à la transposition sur la mutagenèse. Chaque clone mutagenisé est un hémizygote, un hybride diploïde dans lequel un allèle d’un gène est perturbé.
Les hémizygotes sont concurrencés à haute température, et l’ADN est isolé de chaque culture. L’ADN est froissé et ligaté en adaptateurs, et la jonction entre le transposon et le génome est amplifiée par une amorce spécifique au transposon et une amorce spécifique à l’adaptateur. En comptant les comptes de lecture de séquençage en vrac de l’amplicon, signalez l’aptitude d’un clone dans la population.
Avec les résultats en main de ce séquençage, les abondances d’hémizygote pour un gène donné, peuvent être comparées aux deux températures entre deux classes d’hémizygotes. Clones où seul l’allèle S.Cerevisiae était de type sauvage et fonctionnel, et les clones ne s’appuyant que sur l’allèle S.Paradoxus. Dans cette mise en œuvre représentative, des signaux forts sont détectés à huit gènes d’entretien ménager.
Dans chaque cas, les insertions de transposon dans l’allèle de S.Cerevisiae dans l’hybride, ont compromis la croissance à la température élevée. Ces déterminants candidats à faible si représentaient le trait de thermotolerance qui distingue S.Cerevisiae de S.Paradoxus. Maintenant que nous avons terminé cette expérience, nous pouvons disséquer d’autres traits qui diffèrent entre ces espèces, comme la tolérance au froid ou au sel.
