Unsere Methode ist eine der ersten, die in der Lage ist, die genetischen Basen von Merkmalsunterschieden auf einer genomweiten Skala zwischen Arten und nicht innerhalb von Arten zu sezieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie mit hohem Durchsatz, hoher Auflösung und allgemein anwendbar ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, holen Sie den JR507 Gefrierstockstamm aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und streifen Sie ihn zu einzelnen Kolonien auf einer YPD-Agarplatte aus.
Bebrütet bei 26 Grad Celsius für zwei Tage oder bis Kolonien erscheinen. Dann impfen Sie 100 Milliliter flüssiges YPD in einem 250 Milliliter Glaskolben mit einer einzigen Kolonie von JR507, und inkubieren bei 28 Grad Celsius, während sie bei 200 U/min für 24 Stunden oder bis zur stationären Phase geschüttelt werden. Am nächsten Tag messen Sie die od600 der Nachtkultur.
Zurück verdünnen Einige der Nachtkultur mit frischen Flüssig YPD in eine neue Ein-Liter-Flasche, um eine neue Kultur mit einem od600 von NullPunkt zwei und einem Volumen von 500 Milliliter zu schaffen. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei weitere Male, um insgesamt vier Kulturen mit einem od600 von Nullpunkt zwei zu erstellen, wobei die gleiche Nachtkultur für alle neuen Kulturen verwendet wird. Inkubieren Sie alle Kulturen bei 28 Grad Celsius für sechs Stunden, während sie bei 200 RPM schütteln.
Danach kombinieren Sie zwei der 500-Milliliter-Kulturen zu einer Ein-Liter-Kultur. Kombinieren Sie die verbleibenden zwei 500-Milliliter-Kulturen zu einer zweiten Ein-Liter-Kultur. Erstens, teilen Sie jede der Ein-Liter-Kulturen in 20 50 Milliliter Aliquots jeder in einem Kunststoff konischen Rohr für insgesamt 40 Rohre.
20 Rohre beiseite stellen. Zentrifugieren Sie die restlichen 20 Tuben bei 1000 mal G für drei Minuten, um die Hefezellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Pellet mit 25 Milliliter nissterilem Wasser durch Wirbel wieder auf.
Zentrifuge bei 1000 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Pellet mit fünf Millilitern 1X Tris-EDTA Nullpunkt ein Molar-Lithiumacetatpuffer durch Wirbel wieder auf. Zentrifuge bei 1000 mal G für drei Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie jedes Pellet mit fünf Millilitern 1X Tris-EDTA Nullpunkt ein Molar Lithiumacetat Puffer durch Wirbel wieder aus. Zentrifuge bei 1000 mal G für drei Minuten. Während die Zellen zentrifugieren, bereiten Sie mindestens 120 Milliliter einer Lösung vor, die Polyethylenglykol, Lithiumacetat und Tris-EDTA-Puffer enthält.
Bewahren Sie diese Lösung auf Eis auf. Um die Plasma-DNA für die Transformation vorzubereiten, kochen sie zunächst vier Milliliter Lachssperma-DNA bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten. Danach sofort fünf Minuten auf Eis abkühlen.
Mischen Sie 20 Milliliter pJR487 bei einer Konzentration von 538 Nanogramm pro Milliliter mit vier Millilitern der kalten Lachs-Sperma-DNA. Halten Sie diese Mischung auf Eis, bis sie einsatzbereit ist. Als nächstes fügen Sie 600 Mikroliter des Plasma- und Sperma-DNA-Gemischs auf jedem Zellpellet hinzu.
Fügen Sie drei Milliliter der PEG Lithiumacetat TE Mischung zu jedem Pellet hinzu. Wir suspendieren, indem wir auf und ab pfeifen und dann wirbeln. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Dann Hitze Schock jede Röhre in einem Wasserbad bei 39 Grad Celsius für 26 Minuten, stellen Sie sicher, jede Röhre alle paar Minuten umzukehren. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1000 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie jedes Pellet in 10 Milliliter YPD durch Wirbel wieder aus.
Danach alle 20 Tuben zu einem neuen Glaskolben kombinieren. Fügen Sie 433 Punkt vier Milliliter flüssige YPD in eine neue ein Liter Glasflasche. Dann übertragen 66 Punkt sechs Milliliter Zellen in den Kolben.
Wiederholen Sie diesen Übertragungsvorgang zwei weitere Male, um das gesamte Volumen transformierter Zellen zu verwenden. Messen Sie dann die od600 jeder neuen 500-Milliliter-Kultur. Alle drei Kulturen bei 28 Grad Celsius zwei Stunden lang bebrüten, während sie bei 200 Umdrehungen pro Minute schütteln.
Danach fügen Sie null Punkt fünf Milliliter von 300 Milligramm pro Mikroliter G418 zu jedem der Kolben zu einer endigen Konzentration von 300 Mikrogramm pro Milliliter. Bringen Sie die Kolben bei 28 Grad Celsius und 200 U/min in den Schüttel-Inkubator zurück. Wiederholen Sie diesen gesamten Vorgang mit den restlichen 20 konischen Rohren.
An dieser Stelle sollte es sechs Ein-Liter-Flaschen geben, die jeweils 500 Milliliter Zellen mit G418 enthalten. Alle sechs Kolben bei 28 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min etwa zwei Tage oder bis in jedem Kolben ein Od600 von etwa zwei Punkt drei erreicht ist. Kombinieren Sie dann alle sechs Kolben zu einer einzigen Kultur.
Verwenden Sie diese kombinierte Kultur, um zwei neue Ein-Liter-Flaschen mit 500 Milliliter yPD und G418 auf einen od600 von Nullpunkt zwei zu impfen. Bebrüte diese neuen Kulturen über Nacht bei 28 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis sie eine Od600 von etwa zwei Punkt zwei erreicht. Danach verbinden Sie beide Kulturen zu einer einzigen Kultur und messen Sie die od600 der kombinierten Kultur.
Zentrifugieren Sie 25 Milliliter dieser Kultur bei 1000 mal G für drei Minuten. Berechnen Sie die Anzahl der gesamten od600 Einheiten von Zellen, die sich in den 25 Millilitern befinden, wie im Textprotokoll beschrieben. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in genügend Wasser aus, um eine Zellsuspension mit einem od600 von einem Punkt acht fünf Pro Milliliter zu erzeugen.
Mit Glasperlen, Platte einen Milliliter resuspendierte Zellen auf jede der 12 großen, quadratischen kompletten synthetischen Agarplatten mit 5-FOA. Bebrüte jede Platte bei 28 Grad Celsius für ein bis zwei Tage, oder bis sich ein Rasen auf dem Teller bildet. Als nächstes verwenden Sie kleine sterile Rakel, um die Zellen von der Hälfte der Platte abzuschleifen, und in ein Rohr, das 35 Milliliter steriles Wasser enthält.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden sechs Platten, was zu zwei Zellröhren in Wasser führt. Kombinieren Sie die Zellsuspensionen in einem einzigen Kolben, und messen Sie die od600 der Suspension, mit Wasser als Leerling. Verwenden Sie Wasser, um die Zellkonzentration anzupassen, bis der od600 44 Punkt vier pro Milliliter erreicht.
Als nächstes bereiten Sie Gefriervorräte von Zellen vor und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie werden S.Cerevisiae und S.Paradoxus zu einer sterilen Hybride verpaart, die auf Mutagenese übertragen wird. Jeder mutagenisierte Klon ist ein Hemizygote, ein diploider Hybrid, bei dem ein Allel eines Gens gestört wird.
Die Hemizygoten werden bei hohen Temperaturen konkurriert, und die DNA wird aus jeder Kultur isoliert. Die DNA wird gebaggert und an Adapter nuliert, und die Verbindung zwischen Transposon und Genom wird mit einem transposonspezifischen Primer und einem adapterspezifischen Primer verstärkt. Zählen Von Bulk-Sequenzierung Sequencing-Lesezahlen aus dem Amplicon, melden Sie die Eignung eines Klons in der Bevölkerung.
Mit den Ergebnissen in der Hand aus dieser Sequenzierung können die Hemizygoten-Überflussfürhänsen für ein bestimmtes Gen bei den beiden Temperaturen zwischen zwei Klassen von Hemizygoten verglichen werden. Klone, bei denen nur das S.Cerevisiae-Allel wild und funktional war, und Klone, die sich nur auf das S.Paradoxus-Allel verließen. In dieser repräsentativen Implementierung werden starke Signale an acht Haushaltsgenen erkannt.
In jedem Fall beeinträchtigten Transposon-Einfügungen im S.Cerevisiae-Allel im Hybrid das Wachstum bei hohen Temperaturen. Diese Low-Si repräsentierten Kandidatendeterminanten des Thermotoleranzmerkmals, das S.Cerevisiae von S.Paradoxus unterscheidet. Nun, da wir dieses Experiment abgeschlossen haben, können wir andere Merkmale sezieren, die sich zwischen diesen Arten unterscheiden, wie Kälte- oder Salztoleranz.
