我々の方法は、種内ではなく種間のゲノム全体のスケールで形質の違いの遺伝的基盤を解剖することができる最初の一つである。この手法の主な利点は、高スループット、高解像度、および広く適用可能です。この手順を開始するには、JR507冷凍庫在庫株をマイナス80°Cの貯蔵から取り出し、YPD寒天プレート上の単一コロニーにストリークアウトします。
2日間、またはコロニーが出現するまで摂氏26度でインキュベートする。次に、JR507の単一コロニーを有する250ミリリットルガラスフラスコに100ミリリットルの液体YPDを接種し、200RPMで24時間または定常相に達するまで振りながら28°Cでインキュベートする。翌日、一晩培養したod600を測定する。
バックは、新しい1リットルフラスコに新鮮な液体YPDで一晩培養の一部を希釈し、ゼロポイント2のod600と500ミリリットルの体積を持つ新しい文化を作成します。このプロセスをさらに 3 回繰り返して、すべての新しいカルチャに同じ一晩のカルチャを使用して、ゼロ ポイント 2 の od600 を持つ合計 4 つのカルチャを作成します。200 RPMで揺れながら、すべての文化を摂氏28度で6時間インキュベートします。
この後、500ミリリットルの培養物のうちの2つを組み合わせて、1リットルの培養物を作り出します。残りの2つの500ミリリットルの培養物を組み合わせて、2番目の1リットルの培養物を作ります。まず、1リットルの培養物をそれぞれ2050ミリリットルのアリコートに分割し、プラスチック製の円錐管に入れ、合計40本のチューブを使用します。
20本のチューブを脇に置きます。残りの20個のチューブを1000倍Gで3分間遠心し、酵母細胞をペレット化する。上清を捨て、ボルテックスで25ミリリットルの滅菌水で各ペレットを再懸濁する。
遠心分離機はGの1000倍で3分間行う。上清を捨て、ボルテックスにより1X Tris-EDTAゼロ点1モル酢酸リチウム緩衝液の5ミリリットルで各ペレットを再懸濁する。遠心分離機はGの1000倍で3分間行う。
上清を捨て、ボルテックスにより5ミリリットル1XトリスEDTAゼロ点1モル酢酸リチウム緩衝液で再度各ペレットを再懸濁する。遠心分離機はGの1000倍で3分間行う。細胞が遠心分離している間、ポリエチレングリコール、酢酸リチウム、およびTris-EDTAバッファーを含む溶液の少なくとも120ミリリットルを調製する。
このソリューションを氷の上に保管してください。形質転換のために血漿DNAを調製するために、最初に4ミリリットルのサケ精子DNAを摂氏100度で5分間沸騰させる。この後、すぐに5分間氷の上で冷却します。
冷たいサケ精子DNAの4ミリリットルと1ミリリットル当たり538ナノグラムの濃度でpJR487の20ミリリットルを混合する。この混合物を氷の上に置いておいて、使用する準備ができるまで。次に、各細胞ペレットの上に600マイクロリットルの血漿および精子DNA混合物を加える。
各ペレットに3ミリリットルの酢酸リチウムTE混合物を加えます。私たちは、上下にピペットをピペットし、その後渦巻きによって中断します。室温で10分間チューブをインキュベートします。
その後、26分間摂氏39度の水浴で各チューブに熱ショックを与え、各チューブを数分ごとに反転させます。チューブを1000倍Gで3分間遠心分離する。上清を捨て、各ペレットを10ミリリットルのYPDでボルテックスで再懸濁させた。
この後、すべての20チューブを新しいガラスフラスコに組み合わせます。433ポイント4ミリリットルの液体YPDを新しい1リットルガラスフラスコに加えます。その後、フラスコに66ポイント6ミリリットルの細胞を移す。
変換されたセルのボリューム全体を使用するには、この転送プロセスをさらに 2 回繰り返します。次に、新しい500ミリリットル培養のod600を測定する。200 RPMで揺れながら、3つの文化をすべて摂氏28度で2時間インキュベートします。
この後、1ミリリットル当たり300マイクログラムの最終濃度に各フラスコにマイクロリットルG418あたり300ミリグラムのゼロポイント5ミリリットルを加える。フラスコを摂氏28度と200RPMの揺れインキュベーターに戻します。残りの20個の円錐管でこのプロセス全体を繰り返します。
この時点で、6つの1リットルのフラスコがあり、それぞれにG418を加えた500ミリリットルの細胞を含んでいるはずです。200 RPM で約 2 日間、または各フラスコで約 2 ポイント 3 の od600 が到達するまで、6 つのフラスコすべてを摂氏 28 度でインキュベートします。次に、6 つのフラスコをすべて組み合わせて、単一のカルチャを作成します。
この結合培養を使用して、500ミリリットルのYPDおよびG418を有する2つの新しい1リットルフラスコをゼロポイント2のod600に接種する。約2ポイント2のod600に達するまで、200 RPMで揺れ、摂氏28度で一晩これらの新しい文化をインキュベートします。この後、両方の培養を単一の培養物に結合し、結合培養のod600を測定する。
遠心分離機この培養物の25ミリリットルをGの1000倍で3分間用いた。テキスト プロトコルで説明されているように、25 ミリリットルのセルの合計 od600 単位の数を計算します。上清を捨て、1ミリリットル当たり55個の1ポイント8のod600を持つ細胞懸濁液を作成するのに十分な水で細胞を再懸濁する。
ガラスビーズを使用して、再懸濁細胞の1ミリリットルを5-FOAの12の大きな正方形の完全な合成寒天プレートのそれぞれにプレートします。1~2日間、または芝生がプレートに形成されるまで、各プレートを摂氏28度でインキュベートします。次に、小さな滅菌スキージを使用して、プレートの半分から細胞をスクラップし、35ミリリットルの滅菌水を含むチューブに入れます。
残りの6枚のプレートに対してこのプロセスを繰り返し、水中の細胞の2つのチューブを生成します。細胞懸濁液を単一フラスコに組み合わせ、水をブランクとして使用して懸濁液のod600を測定する。od600が44ポイント4ミリリットルに達するまで、水を使用して細胞濃度を調整します。
次に、細胞の冷凍庫の在庫を準備し、テキストプロトコルで概説されているようにマイナス80°Cで保存します。この研究では、S.CerevisiaeとS.Paradoxusが交配して生殖不能ハイブリッドを形成し、突然変異誘発に転置される。各変異原性クローンは、1つの遺伝子の1つの対立遺伝子が破壊されるジプロイドハイブリッドであるヘミジゾーテである。
ヘミジゴは高温で競われ、DNAは各培養物から分離される。DNAはシャーリングされ、アダプターに結び付けられ、トランスポゾンとゲノムの間の接合は、トランスポゾン特異的なプライマーおよびアダプタ特異的プライマーによって増幅される。アンプリコンからのバルクシーケンス読み込みカウントをカウントし、母集団におけるクローンの適合性を報告します。
このシーケンシングからの結果を手にして、与えられた遺伝子のヘミジゴテの豊富さは、2つのクラスのヘミジゴテ間の2つの温度で比較することができる。S.Cerevisiaeアレールだけが野生のタイプと機能的であったクローン、およびクローンはS.Paradoxusアレーレだけに依存していました。この代表的な実装では、8つのハウスキーピング遺伝子で強いシグナルが検出されます。
いずれの場合も、ハイブリッド中のS.Cerevisiaeアレーレ内のトランスポゾン挿入は、高温での成長を損なった。これらの低siは、S.CerevisiaeとS.Paradoxusを区別する耐熱特性の候補決定因子を表した。この実験が完了したので、寒さや塩耐性など、これらの種の間で異なる他の形質を解剖することができます。
