Наш метод является одним из первых, чтобы иметь возможность вскрыть генетические основы черта различия в геноме всей шкале между видами, а не внутри видов. Основными преимуществами этого метода являются высокая пропускная способность, высокое разрешение и широкое применимое. Чтобы начать эту процедуру, получить JR507 морозильник складе штамма из хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию, и полоса его в одиночных колоний на YPD агар пластины.
Инкубировать при 26 градусах по Цельсию в течение двух дней или до тех пор, пока колонии появляются. Затем привить 100 миллилитров жидкого YPD в стеклянной колбе 250 миллилитров с одной колонией JR507 и инкубировать при 28 градусах по Цельсию при встряхивании при 200 об/мин в течение 24 часов или до тех пор, пока не будет достигнута стационарная фаза. На следующий день, мера od600 ночной культуры.
Назад разбавить некоторые из ночной культуры со свежей жидкостью YPD в новый один литр колбы, чтобы создать новую культуру с od600 нулевой точки два и объем 500 миллилитров. Повторите этот процесс еще три раза, чтобы создать в общей сложности четыре культуры с od600 нулевой точки два, используя ту же ночную культуру для всех новых культур. Инкубировать все культуры при 28 градусах по Цельсию в течение шести часов при встряхивании при 200 об/мин.
После этого объединить две из 500 миллилитров культур, чтобы создать один литр культуры. Объедините оставшиеся две культуры 500 миллилитров, чтобы создать вторую литровую культуру. Во-первых, разделить каждую из одной литровой культуры на 20 50 миллилитров aliquots каждый в пластиковой конической трубки в общей сложности 40 трубок.
Отложите 20 трубок. Центрифуга оставшихся 20 труб при 1000 раз G в течение трех минут, чтобы гранулировать дрожжевые клетки. Откажитесь от супернатанта и будем повторно помесить каждую гранулу 25 миллилитров стерильной воды вихрем.
Центрифуга при 1000 раз G в течение трех минут. Отбросьте супернатант, и resuspend каждая гранула с пятью миллилитров 1X Tris-EDTA нулевой точки один мулар литий ацетат буфера вихрем. Центрифуга при 1000 раз G в течение трех минут.
Отбросьте супернатант, и resuspend каждая гранула снова с 5 миллилитров 1X Tris-EDTA нулевая точка одно буфер ацетата molar литием вихрем. Центрифуга при 1000 раз G в течение трех минут. В то время как клетки центрифугируются, приготовьте не менее 120 миллилитров раствора, содержащего полиэтиленгликоль, ацетат лития и буфер Tris-EDTA.
Храните это решение на льду. Чтобы подготовить плазменную ДНК к трансформации, сначала варите четыре миллилитров ДНК спермы лосося при 100 градусах по Цельсию в течение пяти минут. После этого немедленно охлади его на льду в течение пяти минут.
Смешайте 20 миллилитров pJR487 при концентрации 538 нанограмм на миллилитр с четырьмя миллилитров ДНК спермы холодного лосося. Держите эту смесь на льду до готовности к использованию. Затем добавьте 600 микролитров смеси ДНК плазмы и спермы поверх каждой клеточной гранулы.
Добавьте три миллилитров литий-ацетата PEG TE смеси к каждой грануле. Мы приостанавливаем путем трубопроводов вверх и вниз, а затем вихри. Инкубировать трубки при комнатной температуре в течение 10 минут.
Затем тепловой удар каждой трубки в водяной бане при температуре 39 градусов по Цельсию в течение 26 минут, убедившись, что инвертировать каждую трубку каждые несколько минут. Центрифуга труб при 1000 раз G в течение трех минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелите каждую гранулу в 10 миллилитров YPD вихрем.
После этого смешайте все 20 трубок в новую стеклянную колбу. Добавьте 433 точки четыре миллилитров жидкого YPD в новую однолитровую стеклянную колбу. Затем перенесите в колбу 66 тока шесть миллилитров клеток.
Повторите этот процесс передачи еще два раза, чтобы использовать весь объем преобразованных ячеек. Затем измерьте od600 каждой новой культуры 500 миллилитров. Инкубировать все три культуры при 28 градусах по Цельсию в течение двух часов при встряхивании при 200 об/мин.
После этого добавьте нулевую точку пять миллилитров по 300 миллиграммов на микролитр G418 к каждой из колб к окончательной концентрации 300 микрограмм на миллилитр. Верните колбы в трясусь инкубатор при 28 градусах по Цельсию и 200 об/мин. Повторите весь этот процесс с остальными 20 коническими трубками.
На данный момент, должно быть шесть один литр колбы, каждая из которых содержит 500 миллилитров клеток с G418 добавил. Инкубировать все шесть колб при 28 градусах по Цельсию при тряске при 200 об/мин в течение примерно двух дней или до тех пор, пока od600 из примерно двух тока три не будет достигнут в каждой колбе. Затем объединить все шесть колб вместе, чтобы создать единую культуру.
Используйте эту комбинированную культуру, чтобы привить две новые однолитровые колбы с 500 миллилитров YPD и G418 до od600 нулевой точки два. Инкубировать эти новые культуры ночь на 28 градусов по Цельсию с встряхивания на 200 об / мин, пока не достигнет od600 примерно в двух точках два. После этого объединить обе культуры в единую культуру, и измерить od600 объединенной культуры.
Центрифуга 25 миллилитров этой культуры при 1000 раз G в течение трех минут. Рассчитайте общее количество od600 единиц ячеек, которые находятся в 25 миллилитров, как указано в текстовом протоколе. Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в достаточном количествах воды, чтобы создать подвес клетки с od600 одной точки восемью пятью на миллилитр.
Используя стеклянные бусины, пластина один миллилитр resuspended клеток на каждом из 12 больших, квадратных полных синтетических пластин агара с 5-FOA. Инкубировать каждую тарелку при 28 градусах по Цельсию в течение одного-двух дней, или до тех пор, пока газон образуется на тарелке. Затем используйте небольшие стерильные squeegees отказаться от клеток половины пластины, и в трубку, содержащую 35 миллилитров стерильной воды.
Повторите этот процесс для остальных шести пластин, в результате чего две трубки клеток в воде. Объедините подвески клетки в одну колбу, и измерить od600 подвески, используя воду в качестве пробела. Используйте воду, чтобы регулировать концентрацию клеток до тех пор, пока od600 не достигнет 44 точки четыре на миллилитр.
Затем подготовьте морозильные запасы клеток и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании, S.Cerevisiae и S.Paradoxus спариваются, чтобы сформировать стерильный гибрид, который подвергается транспонированию на мутагенез. Каждый мутагенизированный клон является гемизиготой, диплоидным гибридом, в котором нарушается один аллель одного гена.
Гемизиготы соревнуются при высокой температуре, и ДНК изолирована от каждой культуры. ДНК уклоняется и лигатирована к адаптерам, а соединение между транспосоном и геномом усиливается с помощью транспосон-специфической грунтовки и адаптера-специфической грунтовки. Подсчитывая количество секвенирования, читайте подсчеты из ампликона, сообщайте о пригодности клона в популяции.
С результатами в руке от этого sequencing, обилие hemizygote для, котор дали гена, можно сравнить на 2 температурах между 2 типами hemizygotes. Клоны, где только аллель S.Cerevisiae был диким типом и функциональным, и клоны, полагаясь только на аллель S.Paradoxus. В этой репрезентативной реализации, сильные сигналы обнаруживаются на восьми генах домашнего хозяйства.
В каждом случае, транспосонные вставки в аллель S.Cerevisiae в гибриде, скомпрометировали рост при высокой температуре. Эти низкоси представлены кандидат детерминанты термотолерантности черта, которая отличает S.Cerevisiae от S.Paradoxus. Теперь, когда мы завершили этот эксперимент, мы можем вскрыть другие черты, которые отличаются между этими видами, как холодная или соленая толерантность.
