Nosso método é um dos primeiros a ser capaz de dissecar as bases genéticas de diferenças de traços em uma escala genoma entre espécies em vez de dentro de espécies. As principais vantagens desta técnica são que ela é de alta produtividade, alta resolução e amplamente aplicável. Para iniciar este procedimento, recupere a cepa de caldo congelador JR507 do armazenamento a menos 80 graus Celsius, e coloque-a em colônias únicas em uma placa de ágar YPD.
Incubar a 26 graus Celsius por dois dias ou até que as colônias apareçam. Em seguida, inocular 100 mililitros de YPD líquido em um frasco de vidro de 250 mililitros com uma única colônia de JR507, e incubar a 28 graus Celsius enquanto treme a 200 RPM por 24 horas ou até que a fase estacionária seja atingida. No dia seguinte, meça o od600 da cultura da noite para o dia.
De volta diluir parte da cultura da noite para o dia com YPD líquido fresco em um novo frasco de um litro para criar uma nova cultura com um od600 de ponto zero dois e um volume de 500 mililitros. Repita este processo mais três vezes para criar um total de quatro culturas com um od600 de zero ponto dois, usando a mesma cultura da noite para o dia para todas as novas culturas. Incubar todas as culturas a 28 graus Celsius por seis horas enquanto treme a 200 RPM.
Depois disso, combine duas das 500 culturas mililitros para criar uma cultura de um litro. Combine as duas culturas restantes de 500 mililitros para criar uma segunda cultura de um litro. Primeiro, divida cada uma das culturas de um litro em 20 alíquotas de 50 mililitros cada em um tubo cônico plástico para um total de 40 tubos.
Reserve 20 tubos. Centrifugar os 20 tubos restantes a 1000 vezes G durante três minutos para pelotar as células de levedura. Descarte o supernasce e ressuspenque cada pelota com 25 mililitros de água estéril por vórtice.
Centrifugar a 1000 vezes G por três minutos. Descarte o supernascimento e ressuspenque cada pelota com cinco mililitros de 1X Tris-EDTA zero ponto um tampão de acetato molar de lítio por vórtice. Centrifugar a 1000 vezes G por três minutos.
Descarte o supernascimento e ressuspenque cada pelota novamente com cinco mililitros 1X Tris-EDTA zero ponto um tampão de acetato molar de lítio por vórtice. Centrifugar a 1000 vezes G por três minutos. Enquanto as células estão centrifugando, prepare pelo menos 120 mililitros de uma solução contendo polietileno glicol, acetato de lítio e tampão Tris-EDTA.
Guarde essa solução no gelo. Para preparar o DNA de plasma para transformação, primeiro ferva quatro mililitros de DNA de esperma de salmão a 100 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, esfrie-o imediatamente no gelo por cinco minutos.
Misture 20 mililitros de pJR487 a uma concentração de 538 nanogramas por mililitro com quatro mililitros do DNA de esperma de salmão frio. Mantenha esta mistura no gelo até estar pronta para usar. Em seguida, adicione 600 microliters da mistura de plasma e DNA de esperma em cima de cada pelota celular.
Adicione três mililitros da mistura de acetato de lítio PEG à cada pelota. Suspendemos por tubulação para cima e para baixo e, em seguida, vórtice. Incubar os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida, aqueça choque cada tubo em um banho de água a 39 graus Celsius por 26 minutos, certificando-se de inverter cada tubo a cada poucos minutos. Centrifugar os tubos a 1000 vezes G por três minutos. Descarte o supernasce, e resuspenque cada pelota em 10 mililitros de YPD por vórtice.
Depois disso, misture todos os 20 tubos em um novo frasco de vidro. Adicione 433 pontos quatro mililitros de YPD líquido em um novo frasco de vidro de um litro. Em seguida, transfira 66 pontos seis mililitros de células para o frasco.
Repita este processo de transferência mais duas vezes para usar todo o volume de células transformadas. Em seguida, meça o od600 de cada nova cultura de 500 mililitros. Incubar as três culturas a 28 graus Celsius por duas horas enquanto treme a 200 RPM.
Depois disso, adicione zero ponto cinco mililitros de 300 miligramas por microliter G418 a cada um dos frascos a uma concentração final de 300 microgramas por mililitro. Devolva os frascos à incubadora de agitação a 28 graus Celsius e 200 RPM. Repita todo este processo com os 20 tubos cônicos restantes.
Neste ponto, deve haver seis frascos de um litro, cada um contendo 500 mililitros de células com G418 adicionado. Incubar todos os seis frascos a 28 graus Celsius com agitação a 200 RPM por aproximadamente dois dias ou até que um od600 de aproximadamente dois pontos três seja alcançado em cada frasco. Então, combine todos os seis frascos juntos para criar uma única cultura.
Use esta cultura combinada para inocular dois novos frascos de um litro com 500 mililitros de YPD e G418 para um od600 de zero ponto dois. Incubar essas novas culturas durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 RPM até atingir um od600 de aproximadamente dois pontos dois. Depois disso, misture ambas as culturas em uma única cultura, e meça o od600 da cultura combinada.
Centrífuga 25 mililitros desta cultura a 1000 vezes G por três minutos. Calcule o número total de od600 unidades de células que estão nos 25 mililitros conforme descrito no protocolo de texto. Descarte o supernasce, e resuspenque as células em água suficiente para criar uma suspensão celular com um od600 de um ponto oito cinco por mililitro.
Usando contas de vidro, placa um mililitro de células resuspended em cada uma das 12 grandes placas de ágar sintético completas quadradas com 5-FOA. Incubar cada placa a 28 graus Celsius por um a dois dias, ou até que um gramado se forme na placa. Em seguida, use pequenos guinchos estéreis para raspar as células da metade da placa, e em um tubo, contendo 35 mililitros de água estéril.
Repita este processo para as seis placas restantes, resultando em dois tubos de células na água. Misture as suspensões da célula em um único frasco e meça o od600 da suspensão, usando a água como um branco. Use água para ajustar a concentração celular até que o od600 atinja 44 pontos quatro por mililitro.
Em seguida, prepare os estoques congeladores das células e armazene-os a menos 80 graus Celsius, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, S.Cerevisiae e S.Paradoxus são acasalados para formar um híbrido estéril, que é submetido a transposição de mutagênese. Cada clone mutagenizado é um hemizigoto, um híbrido diploide no qual um alelo de um gene é interrompido.
As hemizigos são competidas em alta temperatura, e o DNA é isolado de cada cultura. O DNA é shirred e ligado aos adaptadores, e a junção entre o transposon e o genoma é amplificada com uma cartilha específica transposon e uma cartilha específica do adaptador. Contando a leitura de sequenciamento em massa conta a partir do amplicon, relatar a aptidão de um clone na população.
Com os resultados desta sequência, as abundâncias de hemizigoto para um determinado gene, podem ser comparadas nas duas temperaturas entre duas classes de hemizygotes. Clones onde apenas o alelo S.Cerevisiae era tipo selvagem e funcional, e clones que dependiam apenas do alelo S.Paradoxus. Nesta implementação representativa, sinais fortes são detectados em oito genes de limpeza.
Em cada caso, as inserções transposon no alelo S.Cerevisiae no híbrido, comprometeram o crescimento em alta temperatura. Estes baixos si representaram determinantes candidatos do traço termotolerância que distingue S.Cerevisiae de S.Paradoxus. Agora que completamos este experimento, podemos dissecar outros traços que diferem entre essas espécies, como a tolerância ao frio ou ao sal.
