ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الدور المباشر لتاو في المقصورة النووية مع استبعاد أي تلوث محتمل من التاو السيتوبلازمي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنطبق على نطاق واسع على الدراسة المتعلقة بالوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى وفي ظل ظروف خلوية مختلفة. إثبات الإجراء سيكون جياكومو سيانو، طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبري.
تبدأ عن طريق الطلاء أربع مرات 10 إلى خمس خلايا خط الخلايا الأرومية العصبية البشرية S-SY5Y التي سيتم نقلها مع ناقل التحكم الفارغ، أربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي سيتم تحويلها إلى تاو غير الموسومة، أربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي سيتم إرسالها إلى تاو-NLS، وأربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي يتم نقلها مع تاو-NES في آبار فردية من طبق من ستة آبار. في اليوم التالي للطلاء ، بشكل منفصل احتضان 400 نانوغرام من الحمض النووي والحجم المناسب من الدهون الموجبة في أنبوب واحد من 250 ميكرولترات من المصل المخفض في البئر. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، والجمع بين كل ناقل مع حجم واحد من الدهون الموجبة واحتضان مجمعات الدهون الحمض النووي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، استبدال االنابات في كل بئر مع مليلترين من الثقافة الكاملة الطازجة المتوسطة وtransfect كل بئر مع الحل المناسب الدهون الحمض النووي المعقدة لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل المُتَسَنّون بوسيلة تمايز جديدة. لتحليل لطخة الغربية، وغسل الخلايا المُصابة والمتمايزة في كل بئر مع برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع 500 ميكرولترات من 0.1٪ التربسين في بئر لمدة أربع دقائق في 37 درجة مئوية.
عندما تكون الخلايا قد فصلت، ووقف رد فعل مع حجم متساو من المتوسط كاملة ونقل تعليق الخلية من كل بئر إلى أنابيب الفردية للطرد المركزي. بعد إزالة بعناية من المواد الخارقة، resuspend الكريات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب للطرد المركزي الثاني وإزالة عظمى مرة أخرى. لاستخراج البروتين الكلي، احتضان الكريات لمدة 30 دقيقة على الجليد في 50 إلى 100 ميكرولتر من عازلة تحلل تكملها مثبطات البروتياز والفوسفاتاز.
في نهاية الحضانة، الطرد المركزي استخراج في 16، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة، وتحديد تركيز البروتين عن طريق أي معيار القياس الكمي. ثم اخلط 20 ميكروغرام من كل عينة بروتين مع خمس ميكرولترات من عازل 4X Laemmli إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات وغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بالنسبة للكسر دون الخلوي، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل للعد والدوران لأسفل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل عينة.
لعزل الكسر السيتوسوليك، احتضان الكريات في 100 ميكرولترات من الجليد البارد سيتوبلازمميك استخراج العازلة تكملها مثبطات البروتياز في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي ونقل المابس إلى أنابيب ما قبل التبريد. إضافة 100 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج الأغشية العازلة تستكمل مع مثبطات البروتياز إلى بيليه لاحتضان 10 دقيقة في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف.
ثم الطرد المركزي الكريات لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 3،000 مرات ز وجمع supernatants في أنابيب جديدة. لجمع الكسر النووي القابل للذوبان، أضف 50 ميكرولترات من مخزن الاستخراج النووي المكمّل بمثبطات البروتياز إلى الكريات ذات الدوامة قبل احتضان العينات بأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينات وجمع اابر.
لجمع الكسر النووي غير القابل للذوبان، أضف 50 ميكرولترات من مخزن الاستخراج النووي المكمل بمثبطات البروتياز، كلوريد الكالسيوم والنيوكلاز الدقيق إلى الكريات ذات الدوامة. احتضان العينات لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية قبل دوامة وrifuging. ثم جمع ابر.
لجمع كسر الهيكل العظمي، إضافة 50 ميكرولترات من العازلة استخراج الهيكل العظمي cyto والهيكل العظمي تكملها مثبطات البروتياز إلى الكريات مع دوامة. بعد حضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي العينات وجمع اغراء. لتحليل SDS-PAGE، إضافة سبعة ميكرولترات من 4X Laemmli العازلة إلى 20 ميكرولترات من كل من العينات الكسر دون الخلوية التي تم جمعها وغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
في نهاية الحضانة، تحميل العينات على هلام الاكريلاميد وتنفيذ الكهرباء في الجهد المستمر من 120 فولت. ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز في 250 مللي امبير لمدة 90 دقيقة. احتضان الغشاء لمدة خمس دقائق في بونساو تلطيخ حل للتحقق من وجود البروتين السليم هلام electrophoresis والنشاف ناجحة.
في نهاية الحضانة، شطف الغشاء في الماء المقطر حتى الخلفية نظيفة وإزالة وصمة عار مع الغسيل المستمر مع تريس المخزنة المالحة تكملها توين 20 لمدة 10 دقائق على شاكر. بعد ذلك، احتضان الغشاء مع محلول منع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قبل غسل ثلاث مرات مع محلول ملحي تريس المخزنة بالإضافة إلى توين 20 لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل الأخير ، تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في حل منع بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تليها ثلاثة يغسل مع محلول ملحي تريس المخزنة بالإضافة إلى توين 20 لمدة خمس دقائق.
بعد الغسيل الأخير ، تهجين الغشاء مع جسم مضاد ثانوي مناسب من الفجل peroxidase في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الغشاء بالمحلول الملحي المخزنة على تريس بالإضافة إلى توين 20 ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسيل. بعد الغسيل الأخير ، الكشف عن الفرقة البروتين باستخدام chemiluminescence وقياس شدة عصابات لطخة الغربية من قبل ImageJ. في غياب حمض الريتينويك وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ، والخلايا SH-SY5Y غير المتمايزة تفترض شكل دائري وكتل الخلايا الشكل.
كما هو متوقع ، بعد خمسة أيام من العلاج بحمض الريتينويك ، تسترخي الكتل وتنتشر الخلايا. بعد ثلاثة أيام إضافية من العلاج مع عامل التغذية العصبية المشتقة من الدماغ ، تظهر الخلايا موزعة بشكل موحد ومتشابكة عبر شبكة من النوريات المتفرعة. بعد تاو-NLS أو تاو-NES transfection, تاو التعريب دون الخلوية يمكن الكشف عن طريق immunofluorescence مع الأجسام المضادة المضادة تاو.
اعتمادا على كفاءة transfection، والخلايا عرض تلطيخ نووي قوي مع إشارة DAPI بعد تسربل تاو-NLS أو تلطيخ السيتوبلازمي مع نوى فارغة بعد تاو-NES. ويكشف تحليل البلوط الغربي عن إثراء الـ actin داخل الكسر الهيكلي، والتبولين داخل الكسور السيتوبلازمية والسيكومية، وH2B داخل الكسور النووية. كما يؤكد تحليل البلوط الغربي التعبير عن تاو الموسوم وغير الموسومة داخل المقصورة النووية ونقل الغلوتامات في حويغية تعبير واحد في المقتطف الكلي.
في الواقع، فإن نسبة تاو في الكسور النووية والسيكتوبلازمية القابلة للذوبان تسلط الضوء على حقيقة أن تاو-NLS يتم تخصيبه بدرجة عالية في الجزء النووي القابل للذوبان بينما يتم تقليل تاو-NES. وعلاوة على ذلك، يتم إثراء تاو-NLS في الكسر المرتبط بالكروماتين فيما يتعلق بالكسر السيتوبلازمي بينما ينخفض تاو-NES. تأكد من فحص بعناية عدد الخلايا المستخدمة لتجزئة كل عينة والتحقق من إثراء الجينات التدبير المنزلي في الكسور المناسبة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على عزل المقصورات الخلوية وتقييم الدور الوظيفي لتاو في النواة.
