واحدة من الآليات المقترحة التي تقلل بها الأجسام المضادة العلاجية المضادة تاو من الأمراض في مرض الزهايمر هي امتصاص في إزالة تاو السابق المتراكمة المرضية بواسطة ميكروجليا. هنا، نقدم مقايسة قاعدة الخلية لتقييم امتصاص تاو بواسطة microglia. يمثل هذا الفحص أداة مفيدة للتحقيقات لتوصيف آلية عمل الأجسام المضادة لـ Tau بشكل أفضل.
في اليوم الأول من التجربة، قم بإعداد خلايا BV-2 عن طريق غسلها أولاً بـ 1x PBS في القارورة التي تم استزراعها فيها. ثم احتضان لهم مع 05٪ التربسين EDTA في 37 درجة مئوية و 5٪ C02 حتى ينفصلوا عن القارورة. إعادة تعليق الخلايا في وسط الثقافة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث إلى خمس مرات.
عد الخلايا وإعداد تعليق الخلية مع تركيز نهائي من 100،000 خلية لكل ملليلتر في المتوسطة الثقافة التي تحتوي على 200 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين. إضافة 250 microliters من هذا التعليق الخلية في بئر في 96 ثقافة الأنسجة بشكل جيد لوحة أسفل مسطحة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ C02، بين عشية وضحاها.
بعد ذوبان درجة ح شأن أعدت سابقا صبغ تاو المجاميع على الجليد، وتمييع لهم في 65 ميكرولترات لكل حالة من المصل المتوسطة الحرة، لجعل حل نانومولير 500. تمييع الأجسام المضادة في 65 ميكرولترات من مصل خال المتوسطة لتحقيق ضعف التركيز المطلوب. مزيج صبغة التراكمات صبغ تاو pH والأجسام المضادة في 96 جيدا يو القاع لوحة.
ختم هذه لوحة التخفيف واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي إزالة المتوسطة من لوحة 96 جيدا مع خلايا BV-2. غسل الخلايا في كل بئر مع 100 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة 1X PBS.
إزالة برنامج تلفزيوني من لوحة الخلية BV-2. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 125 ميكرولترات من المجمعات الأمينية من لوحة التخفيف إلى كل بئر من 96 بئر BV-2 لوحة الخلية، واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. بعد الحضانة إزالة المجمعات الأمينية من الخلايا وغسل الخلايا في كل بئر مع 100 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة 1X PBS.
بعد إزالة 1X برنامج تلفزيوني إضافة 50 ميكروليترس من 25٪ تريبسين EDTA واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. بعد ذلك، إضافة 200 ميكروليترس من الاستزراع المتوسطة وإعادة تعليق البئر عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى 96 بئر U-أسفل لوحة والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
ضع الطبق على الجليد، وازيل الوسط. إضافة 150 ميكرولتردات من الجليد البارد 1X برنامج تلفزيوني والطرد المركزي مرة أخرى في 400 غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع لوحة على الجليد وغسل مرة أخرى عن طريق إزالة وأضاف سابقا 1X برنامج تلفزيوني وإضافة 150 ميكرولترات من الجليد البارد PBS في البئر.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف. ضع اللوحة على الجليد وغسل الخلايا عن طريق إزالة PBS المضافة سابقًا وإضافة 150 ميكرولترات المخزن المؤقت FACS في البئر. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 400 غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
ضع اللوحة على الجليد وأزل حاجز FACS المضاف سابقًا ثم قم بإعادة تعليق الخلايا في 200 وحدة تخزين فاكس لكل بئر. المضي قدما على الفور لتحليل من قبل FACS للحصول على 20،000 الأحداث في بوابة الخلية الحية. لتحليل FACS استخدام منطقة التشتت إلى الأمام أو FSCA مقابل منطقة التشتت الجانبية أو مؤامرة كثافة SSCA إلى بوابة على الخلايا الحية باستبعاد الأحداث ذات مستويات التشتت الأمامية المنخفضة، مثل الحطام والخلايا الميتة.
ثم داخل مجموعة الخلايا الحية استخدام FSCA مقابل الارتفاع إلى الأمام مبعثر أو FSCH لإنشاء بوابة مفردة واستبعاد مزدوجة الخلية والمجاميع. ثم استخدام الأحداث في بوابة singlet لتوليد الرسم البياني معلمة واحدة صبغة رقمH. استخدم الرسم البياني الذي تم إنشاؤه لتحديد متوسط شدة الفلورس أولاً.
بعد ذلك تحديد النسبة المئوية للhH صبغ تاو الخلايا الإيجابية عن طريق استبعاد الخلايا السالبة كما يحدد باستخدام التحكم الوحيد BV-2. CBTau-28.1 الأجسام المضادة تعزيز امتصاص تاو في خلايا BV-2 بطريقة تعتمد على الجرعة كما هو مبين من قبل عملية استئصال الخلايا تدفق. ارتفاع تقارب مزدوج متحولة CBTau-28.1 الأجسام المضادة توسط تاو امتصاص في خلايا BV-2 إلى مدى أعلى من الجسم المضاد من النوع البرية.
لم CBTau-28.1 شظايا فاب زيادة امتصاص تاو القاعدية مما يدل على مستقبلات FC توسطت في استيعاب آلية. وأكد المجهر Confocal الأجسام المضادة بوساطة زيادة امتصاص تاو. صبغة الحموضة الخضراء المسمى المجاميع تاو في كثير من الأحيان المشتركة مع lysotracker الأحمر صبغة حمضية ملطخة مما يوحي بوجود مجاميع تاو في مقصورة endolysosomal.
CBTau-28.1 شظايا فاب لم زيادة تاو امتصاص مرة أخرى مشيرا إلى أن امتصاص كان في الواقع FC بوساطة. الفحص الذي وصفه للتو يسمح لنا لتحديد كمية الأجسام المضادة بوساطة تاو امتصاص من قبل microglia. يمكن أن تساعد البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا الفحص في توضيح آلية عمل الأجسام المضادة المضادة لـ Tau مما يمثل أداة مفيدة للنهوض بالأجسام المضادة المضادة لـ Tau لمزيد من الخطوات في تطويرها كعلاج محتمل للد.
