يصف هذا الإجراء ثلاثة نماذج من الفئران المناعية الأنسمنة لدراسة ديناميات العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية. NSG الفئران أنساء يلخص ملامح المناعة البشرية. في هذه الحالة، السماح بدراسة الإصابة المزمنة والحادة، وإعادة تنشيط الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في البيئات السابقة السريرية.
إثبات عملية إعداد الخلية ستكون ساندرا مدينا مورينو، مشرفة أبحاث مختبرية من مجموعتنا. عند تنفيذ هذا الإجراء، دائما استخدام معدات الحماية الشخصية القابل للتصرف بما في ذلك الدعك المعقم، والقفازات، والأحذية المخصصة، وأغطية الأحذية، قناع، نظارات واقية، الشعر وأغطية اللحية، ومعطف مختبر معقمة. بالنسبة للنموذج المزمن، إعادة اعتماد مليون خلية CD34 + الخلايا الجذعية البشرية المجمدة في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI 1640 مع 10٪ FBS تحت خزانة السلامة الحيوية المعتمدة والحفاظ على ظروف معقمة.
استخدام 10 ميكرولترات من التعليق لحساب والتحقق من صلاحية الخلية من قبل استبعاد Trypan الأزرق تلطيخ في قياس الهيموسيت. ثم الطرد المركزي تعليق الخلية في 400 مرة ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل فائقة و resuspend الخلايا في PBS 1X الباردة في التركيز المطلوب.
إبقاء الخلايا على الجليد حتى الحقن. فرك الفراش نظيفة بين اليدين لإخفاء أي الروائح الأجنبية الأخرى على الجراء المتلقي. ثم ضع الجراء في طبق بيتري معقم مساحته 100 ملليمتر مربع مع كمية صغيرة من مواد الفراش من قفص المربي.
وضع طبق بيتري في قفص نقل نظيفة ومن ثم وضع القفص في قفص نقل كاربوي لحماية الجراء من الضوء المباشر والضوضاء. تغطية قفص النقل مع لوحة غطاء لتجنب التعرض للحيوانات للبيئة أثناء العبور إلى غرفة التشعيع. بعد التخدير كما هو موضح في بروتوكول النص، والاستعداد لengraftment عن طريق حقن الكبد.
لتقليل وقت ضبط النفس في الفأر، دع أحد المحققين يقوم بتحميل الحقنة مع تعليق الخلايا الجذعية، واجعل المحقق الثاني يمسك الجرو ويدير الحقنة. تحميل 50 ميكرولترات من CD34 + تعليق الخلايا الجذعية البشرية في حقنة مع إبرة المرفقة تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المعتمدة. تقييد الجراء مع الإبهام وأصابع المؤشر وتنظيف موقع الحقن مع 70٪ الكحول.
استخدام زاوية إبرة ضحلة لتقديم 50 ميكرولترات من الخلايا مباشرة في الكبد حتى لا تخترق الكبد تماما. قبل الدفء الطبق باستخدام وسادة الاحترار الأشعة تحت الحمراء للقوارض في 20 درجة مئوية لضمان الجراء لن يكون أكثر من الدفء. ضع الجراء على طبق بيتري المغطى بالشاش العقيم لمدة دقيقة إلى خمس دقائق للسماح بالتعافي.
مباشرة قبل العودة الجراء إلى والديهم، وتطبيق كمية صغيرة من المنثول والمرهم القائم على الأوكالبتوس باستخدام الإبهام وأصابع مؤشر على خطم كلا الوالدين لتجنب أكل لحوم البشر أو رفض الجراء. تحقق من الأقفاص اليومية ، وتبحث عن أي علامات الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف في الجراء مثل الجلد الجاف ، لا تغذية ، طفح جلدي ، أو ثعلبة. فَرّمَ الجراء في ثلاثة أسابيعِ من العمرِ ويَعْنيهم في أقفاصِ مختلفةِ.
تحقق من الحفة في الدم المحيطي عن طريق عملية التنقية المتدفقة في عمر 14 أسبوعًا. وتظهر استراتيجية تمثيلية لـ "البوابات" لتقييم إعادة بناء الخلايا CD45+الخلية البشرية والنسبة المئوية للخلايا CD4+وC8+T. معدل نجاح engraftment هو ما بين 80٪ إلى 100٪ استخدام خلايا أحادية النوى الدم الطرفية البشرية المستمدة من متبرع سليم للنموذج الحاد أو من مريض مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية الذي كان تحت العلاج المضاد للفيروسات العكوسة لنموذج إعادة تنشيط.
طبقة 15 ملليلتر من الدم كله في خمسة ملليلتر من كثافة معقم التدرج المتوسطة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 400 مرة ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون فواصل لتجنب معطف بافي من أن تصبح مختلطة مع متوسط الكثافة الانحدار. جمع بعناية جزء من الخلايا أحادية النوى بين متوسط الكثافة الانحدار وsupernatant.
نقل معطف بافي إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من 1X PBS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant وإزالة خلايا الدم الحمراء المتبقية عن طريق التحلل مع خمسة ملليلتر من ACK تحلل العازلة المضافة إلى الخلايا بيليه.
احتضان لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل، والتخلص من عظمى وrsuspend في 10 ملليلتر من 1X PBS أو RPMI 1640 المتوسطة. استخدام 10 ميكرولترات من تعليق الخلية لحساب الخلايا والتحقق من قابلية البقاء عن طريق استبعاد Trypan الأزرق تلطيخ في قياس الهيموسيت.
عادة، يتم الحصول على واحد إلى اثنين من الخلايا مليون لكل ملليلتر من الدم مع أكثر من 95٪ قابلية البقاء. بعد الطرد المركزي كما كان من قبل، والتخلص من عظمى وضبط عدد الخلايا إلى التركيز المطلوب. تحميل 3.5 مليون خلية أحادية النوى الدم المحيطية في 200 ميكرولترات من 1X PBS في حقنة مع إبرة مرفقة تحت خزانة السلامة البيولوجية المعتمدة.
إزالة الماوس من القفص وعقد عليه من قبل الذيل بحيث يمكن قبضة شبكة تطبيق الجر لطيف إلى الوراء. ثم ضع السبابة والإبهام على أكتاف الحيوان الاستيلاء على الجلد فضفاضة من الرقبة واستخدام الاصبع الأوسط لتحقيق الاستقرار في ظهره. حرك رأس الماوس للخلف بحيث يكون ظهره فوق رأسه.
وهذا يسمح لل الحشو في تجويف البطن أن يكون المشردين إلى الوراء ويقلل من خطر ثقب الأعضاء الداخلية أثناء الحقن. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ الكحول. اختراق الحقنة المعدة من خلال جدار البطن والطامح قبل حقن الخلايا.
إذا تم استنشق أي مادة، إزالة الحقنة والتخلص منها. خلاف ذلك ، حقن الخلايا ببطء في تجويف intraperitoneal قبل إزالة الحقنة والتخلص منها. أعد الحيوان إلى قفصه وتحقق من النقاب في الدم المحيطي عن طريق قياس تدفق الاليات في ثلاثة أسابيع بعد الحقن.
تحديد الفئران بواسطة وضع علامات الأذن. مراقبة الفئران المستخدمة في هذه التجارب عن كثب، مرتين في اليوم بعد كل إجراء لعلامات الضائقة السريرية. ثم انتقل إلى حقن فيروس نقص المناعة البشرية كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد حقن فيروس نقص المناعة البشرية، هناك زيادة سريعة في الحمل الفيروسي البلازما عادة ما يكون يمكن الكشف عنها بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع بعد العدوى في كل من النماذج المزمنة والحادية مع الحركية مماثلة في نموذج إعادة التنشيط. وتتزامن الزيادة في الحمل الفيروسي مع انخفاض نسبة CD4:CD8. لا يتم ملاحظة هذه التغييرات في أجهزة الماوس التحكم.
وتجدر الإشارة إلى أنه في نموذج الماوس البالغ من نوع PBMC NSG، لوحظ انعكاس أولي لنسبة CD4:CD8 وإعادة تشكيله على طول وقت الرصد. عندما يتم إعطاء العلاج المضاد للفيروسات العكوسة للفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، حدث قمع الحمل الفيروسي وكذلك الانتعاش في نسبة CD4:CD8 كما هو متوقع الوصول إلى مستويات مماثلة لتلك الموجودة في الضوابط غير المصابة. عادة، بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من العلاج، لوحظ انخفاض في الحمل الفيروسي وزيادة في نسبة CD4:CD8 في النماذج المزمنة والحادة، وإعادة التنشيط.
استخدم جرعة التشعيع الموصى بها لتجنب الجرعة الزائدة القاتلة أو رفض الخلايا المزروعة. لا تخترق تماما الكبد أثناء الحقن واستخدام الفراش لإخفاء الروائح التي سوف ترى السد على أنها أجنبية. وتسمح هذه النماذج الثلاثة باختبار المركبات المضادة للفيروسات، أو الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية أو غيرها من المواد البيولوجية التي تؤثر على النسخ الفيروسي.
وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تسمح بإجراء تجارب نقل تكيفية للعلاج المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية. يمكن إعادة تشكيل الفئران البشرية NSG جزئيًا أو كاملًا مع الخلايا البشرية للاستجابة لمسببات الأمراض أو الأدوية ، مما يحاكي تعقيد جهاز المناعة البشري. جميع التدابير البيولوجية الأساسية يجب أن تتبع بدقة منذ NSG يمكن أن تكون الفئران أنس ما هو عليه مع كل من مورين والمسببات البشرية، وخاصة في هذه الحالة التي تستخدم فيروس نقص المناعة البشرية التلاعب.
