Cette procédure décrit trois modèles de souris immunodéficientes humanisées pour l’étude de la dynamique de l’infection par le VIH. Les souris humanisées NSG récapitulent sur les caractéristiques de l’immunité humaine. Dans ce cas, permettant l’étude de l’infection chronique, aiguë et réactivée du VIH dans des contextes préclinique.
Sandra Medina-Moreno, superviseure de recherche en laboratoire de notre groupe, démontrera la procédure de préparation cellulaire. Lors de l’exécution de cette procédure, utilisez toujours de l’équipement de protection individuelle jetable, y compris des gommages stériles, des gants, des chaussures dédiées, des couvre-chaussures, un masque, des lunettes, des bonnets de cheveux et de barbe, et un manteau stérile de laboratoire. Pour le modèle chronique, resuspendez un million de cellules souches cd34+humaines congelées dans 10 millilitres de rpmi 1640 médias avec 10%FBS dans une armoire de biosécurité certifiée et maintenir des conditions stériles.
Utilisez 10 microlitres de la suspension pour compter et vérifier la viabilité des cellules en colorant trypan blue exclusion dans un hémomètre. Puis centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant 15 minutes à température ambiante. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans le 1X PBS froid à la concentration requise.
Garder les cellules sur la glace jusqu’à l’injection. Frottez la literie propre entre les mains pour masquer toute autre odeur étrangère sur les chiots destinataires. Ensuite, placez les chiots dans une boîte de Pétri stérile de 100 millimètres carrés avec une petite quantité de matériel de literie de la cage d’éleveur.
Mettez la boîte de Petri dans une cage de transport propre, puis placez la cage dans une cage de transport Carboy pour protéger les chiots de la lumière directe et du bruit. Couvrez la cage de transport d’une garniture de couverture pour éviter l’exposition des animaux à l’environnement pendant le transit vers la salle d’irradiation. Après l’anesthésie décrite dans le protocole du texte, préparez-vous à l’engraftment par injection hépatique.
Pour minimiser le temps de retenue de la souris, laissez un enquêteur charger la seringue avec la suspension des cellules souches et demander au deuxième enquêteur de tenir le chiot et d’administrer l’injection. Chargez 50 microlitres de la suspension des cellules souches humaines CD34+dans la seringue avec une aiguille attachée sous l’armoire de biosécurité certifiée. Retenir les chiots avec le pouce et les index et nettoyer le site d’injection avec 70% d’alcool.
Utilisez un angle d’aiguille peu profond pour livrer 50 microlitres de cellules directement dans le foie afin de ne pas percer complètement le foie. Préchauffer le plat à l’aide d’un coussin chauffant infrarouge pour les rongeurs à 20 degrés Celsius pour s’assurer que les chiots ne seront pas surchauffés. Déposer les chiots sur la boîte de Pétri recouverte de gaze stérile pendant une à cinq minutes pour permettre la récupération.
Immédiatement avant de retourner les chiots à leurs parents, appliquez une petite quantité d’onguent à base de menthol et d’eucalyptus à l’aide du pouce et des index au museau des deux parents pour éviter le cannibalisme ou le rejet des chiots. Vérifiez les cages tous les jours, à la recherche de tout signe de greffe par rapport à la maladie de l’hôte chez les chiots tels que la peau sèche, pas d’alimentation, éruption cutanée, ou l’alopécie. Sevrer les chiots à l’âge de trois semaines et les loger dans différentes cages.
Vérifiez l’engraftment dans le sang périphérique par cytométrie de flux à 14 semaines d’âge. Une stratégie de gating représentative pour l’évaluation de la reconstruction humaine de CD45+cellule et du pourcentage des cellules CD4+et CD8+T est montrée. Le taux de réussite de l’engraftment se situe entre 80 % et 100 % Utilisez des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines dérivées d’un donneur sain pour le modèle aigu ou d’un patient infecté par le VIH qui était sous traitement antirétroviral pour le modèle de réactivation.
Superposer 15 millilitres de sang entier en cinq millilitres de gradient de densité stérile moyen dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse à 400 fois g pendant 30 minutes à température ambiante sans pauses pour éviter que le pelage bouffi ne se mélange avec le milieu de gradient de densité. Recueillir soigneusement la fraction des cellules mononucléaires entre le milieu de gradient de densité et le surnatant.
Transférer le pelage bouffi dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 1X PBS. Centrifugeuse à 300 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le supernatant et retirez les globules rouges restants en lysant avec cinq millilitres de tampon de lyse ACK ajoutés aux cellules granulées.
Incuber pendant quatre minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé à nouveau comme avant, jeter le supernatant et resuspendre en 10 millilitres de 1X PBS ou RPMI 1640 moyen. Utilisez 10 microlitres de la suspension cellulaire pour compter les cellules et vérifier la viabilité par trypan bleu tache d’exclusion dans un hémocytomètre.
Typiquement, un à deux millions de cellules sont obtenues pour chaque millilitre de sang avec plus de 95% viabilité. Après centrifugation comme avant, jetez le supernatant et ajustez le numéro de cellule à la concentration requise. Chargez 3,5 millions de cellules mononucléaires périphériques de sang dans 200 microlitres de 1X PBS dans une seringue avec une aiguille attachée sous une armoire certifiée de biosécurité.
Retirez la souris de la cage et maintenez-la par la queue afin qu’elle puisse saisir le maillage en appliquant une traction douce vers l’arrière. Ensuite, placez l’index et le pouce sur les épaules de l’animal saisissant la peau lâche du cou et en utilisant le majeur pour stabiliser son dos. Faites glisser la tête de la souris vers l’arrière de sorte que son dos est au-dessus de sa tête.
Cela permet aux viscères de la cavité abdominale d’être déplacés vers l’arrière et réduit le risque de ponctuation des organes internes pendant l’injection. Nettoyez le site d’injection avec 70% d’alcool. Pénétrer la seringue préparée à travers la paroi abdominale et aspirer avant d’injecter les cellules.
Si un matériau est aspiré, retirez la seringue et jetez-la. Sinon, injectez les cellules lentement dans la cavité intraperitoneal avant d’enlever la seringue et de la jeter. Retournez l’animal dans sa cage et vérifiez l’engraftment dans le sang périphérique par cytométrie de flux à trois semaines après injection.
Identifiez les souris par marquage auditif. Observez de près les souris utilisées dans ces expériences, deux fois par jour après chaque intervention pour les signes cliniques de détresse. Ensuite, passez à l’injection du VIH tel que décrit dans le protocole texte.
Après l’injection du VIH, il y a une augmentation rapide de la charge virale plasmatique habituellement détectable après deux à trois semaines après l’infection dans les modèles chroniques et aigus avec la cinétique semblable dans le modèle de réactivation. L’augmentation de la charge virale coïncide avec une diminution du rapport CD4:CD8. Ces changements ne sont pas observés chez les souris témoins.
Il convient de noter que dans le modèle humanisé de souris adultes PBMC NSG, une inversion initiale du rapport CD4:CD8 est observée et reconstituée le long du temps de surveillance. Lorsque le traitement antirétroviral est administré à des souris infectées par le VIH, une suppression de la charge virale ainsi que le rétablissement du rapport CD4:CD8 se sont produits comme prévu pour atteindre des niveaux similaires à ceux des témoins non infectés. Typiquement, après deux à trois semaines de traitement, une diminution de la charge virale et une augmentation du rapport CD4:CD8 sont observées dans les modèles chroniques, aigus et de réactivation.
Utilisez la dose d’irradiation recommandée pour éviter une surdose mortelle ou le rejet de cellules transplantées. Ne percez pas complètement le foie pendant l’injection et utilisez la literie pour masquer les odeurs que le barrage percevra comme étrangères. Ces trois modèles permettent de tester des composés antiviraux, des anticorps anti-VIH ou d’autres substances biologiques qui affectent la réplication virale.
En outre, ils permettent des expériences de transfert adaptatif pour l’immunothérapie du VIH. Les souris humanisées nsg peuvent être reconstituées partiellement ou en totalité avec des cellules humaines pour répondre aux agents pathogènes ou aux médicaments, imitant la complexité du système immunitaire humain. Toutes les mesures biologiques de base doivent être strictement suivies puisque les souris humanisées du NSG peuvent être infectées par des agents pathogènes murins et humains, en particulier dans ce cas qui utilise la manipulation du virus VIH.
