この手順は、HIV感染のダイナミクスの研究のためのヒト化免疫不全マウスの3つのモデルを説明する。NSGヒト化マウスは、ヒト免疫の特徴を再現する。この場合、慢性、急性、および再活性化されたHIV感染の研究を前臨床現場で可能にする。
細胞の準備手順を実証するサンドラメディナモレノ、私たちのグループの研究室の研究スーパーバイザーです。この手順を実行する場合は、常に滅菌スクラブ、手袋、専用の靴、靴カバー、マスク、ゴーグル、髪とひげボンネット、および無菌ラボコートを含む使い捨ての個人的な保護具を使用してください。慢性モデルの場合、認定バイオセーフティキャビネットの下で10%FBSのRPMI 1640培地の10ミリリットルに100万個の凍結CD34+ヒト幹細胞を再中断し、無菌状態を維持します。
10マイクロリットルの懸濁液を使用して、血球計でトリパンブルー除外染色により細胞の生存率をカウントして確認します。その後、細胞懸濁液を室温で15分間400回gで遠心する。上清を捨て、必要な濃度で冷たい1X PBSで細胞を再懸濁する。
細胞を射出するまで氷の上に置いておきます。手の間にきれいな寝具をこすり、レシピエントの子犬の他の外国臭を隠します。その後、ブリーダーケージから少量の寝具材料と一緒に無菌100平方ミリメートルペトリ皿に子犬を置きます。
ペトリ皿をきれいな輸送ケージに入れ、ケージをカーボイ輸送ケージに入れて、子犬を直接光や騒音から保護します。照射室への輸送中に環境への動物の暴露を避けるためにカバーパッドで輸送ケージをカバー。テキストプロトコルに記載されている麻酔に続いて、肝注射を介して生着の準備をする。
マウスの拘束時間を最小限に抑えるために、1人の研究者に幹細胞懸濁液を注射器に積み込ませ、2人目の研究者に子犬を保持させ、注射を投与させる。認定バイオセーフティキャビネットの下に付属の針で、CD34+ヒト幹細胞懸濁液の50マイクロリットルを注射器にロードします。親指と人差し指で子犬を拘束し、70%アルコールで注射部位をきれいにします。
浅い針の角度を使用して、肝臓に直接50マイクロリットルの細胞を送達し、肝臓を完全に突き刺さないようにします。20°Cのげっ歯類のための赤外線ウォーミングパッドを使用して料理を事前に温め、子犬が温め過ぎないようにします。ペトリ皿に害虫ガーゼで覆われた子犬を1〜5分間置き、回復を可能にします。
子犬を両親に返す直前に、親指と人差し指を使って少量のメントールとユーカリベースの軟膏を両親のスナッに塗布して、カニバリズムや子犬の拒絶を避けます。乾燥肌、授乳なし、発疹、脱毛症などの子犬の移植片対宿主病の兆候を毎日調べてください。子犬を3週間で引き分け、別のケージに入れます。
14週齢で、フローサイトメトリーによる末梢血の生着を確認する。ヒトCD45+細胞再構成の評価とCD4+およびCD8+T細胞の割合の評価のための代表的な格言戦略が示されている。生着の成功率は80%から100%の間で急性モデルまたは再活性化モデルのための抗レトロウイルス療法を受けていたHIV感染患者に対して健康なドナーから誘導されたヒト末梢血単核細胞を使用する。
50ミリリットルの円錐管に5ミリリットルの無菌密度勾配培地中の全血の層15ミリリットル。400回gで400倍の遠心分離機を、バフィーコートが密度勾配媒体と混合するのを避けるために、休憩なしで室温で30分間。密度勾配媒体と上清の間の単核細胞の分画を慎重に収集する。
1X PBSの10ミリリットルを含む15ミリリットルの遠心分離管にバフィーコートを移します。室温で10分間300回gで遠心分離機。上清を捨て、ペレット化された細胞に加えたACKリシスバッファーの5ミリリットルでlysingすることによって残りの赤血球を除去する。
室温で4分間インキュベートします。前のように再び遠心分離した後、上清を捨て、1X PBSまたはRPMI 1640培地の10ミリリットルで再懸濁する。細胞懸濁液の10マイクロリットルを使用して細胞を数え、血球計でトリパンブルー除外染色によって生存率を確認する。
典型的には、95%以上の生存率を有する1ミリリットルの血液に対して1〜200万個の細胞が得られる。前のように遠心分離に続いて、上清を捨て、必要な濃度に細胞数を調整する。1X PBSの200マイクロリットルに350万個の末梢血単核細胞を、認定バイオセーフティキャビネットの下に針を取り付けた注射器にロードします。
ケージからマウスを取り出し、尾で保持して、優しいトラクションを適用して後方に優しい牽引力を適用してメッシュを握ることができるようにします。その後、首の緩い皮膚をつかみ、中指を使って背中を安定させる動物の肩に人差し指と親指を置きます。マウスの頭を後方にスライドさせて、後ろが頭の上になるようにします。
これにより、腹腔内の内臓を後方に置き換え、注射中に内臓を穿刺するリスクを軽減します。70%アルコールで注射部位をきれいにしなさい。調製した注射器を腹壁を通して浸透し、細胞を注入する前に吸引する。
材料が吸引された場合は、注射器を取り出して捨てます。それ以外の場合は、シリンジを取り除いて廃棄する前に、腹腔内の細胞をゆっくりと注入します。動物をケージに戻し、注射後3週間で流動サイトメトリーによる末梢血の生着を確認する。
耳のタグ付けによってマウスを識別します。これらの実験で使用されるマウスを注意深く観察し、苦痛の臨床徴候について各処置の後1日2回観察する。次に、テキストプロトコルに記載されているようにHIV注射に進みます。
HIV注射後、再活性化モデルにおいて同様の運動薬を持つ慢性および急性モデルの両方で、感染後2〜3週間後に通常検出可能である血漿ウイルス負荷の急激な増加がある。ウイルス負荷の増加はCD4:CD8比の減少と一致する。これらの変化は、コントロールマウスでは観察されない。
なお、ヒト化PBMC NSG成人マウスモデルにおいて、CD4:CD8比の初期反転が観察され、モニタリング時間に沿って再構成される。抗レトロウイルス療法がHIV感染マウスに投与されると、ウイルス負荷の抑制とCD4:CD8比の回復が、感染していない対照のものと同様のレベルに達すると予想通り起こった。典型的には、2〜3週間の治療の後、ウイルス負荷の減少およびCD4:CD8比の増加は、慢性、急性、および再活性化モデルにおいて観察される。
移植細胞の致死的な過剰摂取や拒絶反応を避けるために推奨される照射線量を使用してください。注射中に肝臓を完全に突き刺し、ダムが異物として知覚する臭いをマスクするために寝具を使用しないでください。これらの3つのモデルは、抗ウイルス化合物、抗HIV抗体またはウイルス複製に影響を与える他の生物学的物質の試験を可能にする。
さらに、それらはHIV免疫療法のための適応的伝達実験を可能にする。NSGヒト化マウスは、ヒト免疫系の複雑さを模倣して、病原体または薬物に反応するために、部分的またはヒト細胞で完全に再構成することができる。NSGヒト化マウスは、特にHIVウイルス操作を使用するこの場合、マウスとヒト病原体の両方に感染することができるので、すべての基本的な生物学的措置は厳密に従う必要があります。
