Dieses Verfahren beschreibt drei Modelle humanisierter immundefiziater Mäuse für die Untersuchung der Dynamik einer HIV-Infektion. NSG humanisierte Mäuse rekapitulieren auf Merkmale der menschlichen Immunität. In diesem Fall, die Untersuchung der chronischen, akuten und reaktivierten HIV-Infektion in präklinischen Umgebungen.
Demonstriert wird das Zellpräparat sverfahren: Sandra Medina-Moreno, Laborforschungsleiterin aus unserer Gruppe. Verwenden Sie bei dieser Durchführung dieses Verfahrens immer persönliche Einwegschutzausrüstung, einschließlich steriler Peelings, Handschuhe, spezielle Schuhe, Schuhbezüge, Maske, Brille, Haar- und Barthauben und einen sterilen Labormantel. Für das chronische Modell, resuspend eine Million gefrorene CD34 + menschliche Stammzellen in 10 Milliliter RPMI 1640 Medien mit 10%FBS unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank und halten sterile Bedingungen.
Verwenden Sie 10 Mikroliter der Suspension, um die Zelllebensfähigkeit durch Trypan Blue-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer zu zählen und zu überprüfen. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 400 mal g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in kalten 1X PBS in der erforderlichen Konzentration wieder aus.
Halten Sie die Zellen auf Eis bis zur Injektion. Reiben Sie saubere Bettwäsche zwischen den Händen, um alle anderen fremden Gerüche auf den EmpfängerWelpen zu maskieren. Dann legen Sie Welpen in eine sterile 100 Quadratmillimeter Petrischale zusammen mit einer kleinen Menge Vonstreumaterial aus dem Züchterkäfig.
Legen Sie die Petrischale in einen sauberen Transportkäfig und legen Sie den Käfig dann in einen Carboy Transportkäfig, um Welpen vor direktem Licht und Lärm zu schützen. Bedecken Sie den Transportkäfig mit einem Abdeck, um die Exposition von Tieren gegenüber der Umwelt während des Transports zum Bestrahlungsraum zu vermeiden. Nach der Anästhesisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Transplantation durch Leberinjektion vor.
Um die Zeit der Mauszurückhaltung zu minimieren, lassen Sie einen Prüfer die Spritze mit der Stammzellsuspension beladen und lassen Sie den zweiten Prüfer den Welpen halten und die Injektion verabreichen. 50 Mikroliter der CD34+human entoserten Stammzellsuspension mit einer beigefügten Nadel unter den zertifizierten Biosicherheitsschrank in die Spritze geben. Halten Sie die Welpen mit Daumen und Zeigefinger zurück und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol.
Verwenden Sie einen flachen Nadelwinkel, um 50 Mikroliter Zellen direkt in die Leber zu liefern, um die Leber nicht vollständig zu durchbohren. Die Schale mit einem Infrarot-Wärmepolster für Nagetiere bei 20 Grad Celsius vorwärmen, um sicherzustellen, dass die Welpen nicht überwärmt werden. Legen Sie die Welpen auf die Petrischale mit steriler Gaze für ein bis fünf Minuten bedeckt, um eine Erholung zu ermöglichen.
Unmittelbar vor der Rückgabe der Welpen an ihre Eltern, wenden Sie eine kleine Menge Menthol und Eukalyptus-basierte Salbe mit dem Daumen und Zeigefinger auf die Schnis beider Eltern, um Kannibalismus oder Ablehnung der Welpen zu vermeiden. Überprüfen Sie Käfige jeden Tag, auf der Suche nach Anzeichen von Transplantat versus Wirtskrankheit in den Welpen wie trockene Haut, keine Fütterung, Hautausschlag, oder Alopezie. Entwöhnen Sie die Welpen im Alter von drei Wochen und beherbergen sie in verschiedenen Käfigen.
Verifizieren Sie die Engraftmentierung im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie im Alter von 14 Wochen. Es wird eine repräsentative Gating-Strategie für die Bewertung der menschlichen CD45+Zell-Rekonstruktion und des Prozentsatzes der CD4+- und CD8+T-Zellen angezeigt. Die Erfolgsrate der Engraftmentistin liegt zwischen 80% und 100%Verwenden Sie menschliche periphere mononukleäre Blutzellen, die von einem gesunden Spender für das akute Modell oder von einem HIV-infizierten Patienten abgeleitet wurden, der sich für das Reaktivierungsmodell einer antiretroviralen Therapie unterzog.
15 Milliliter Vollblut in fünf Millilitern steriler Dichte schichte medium in eine 50 Milliliter konische Röhre. Zentrifuge bei 400 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Pausen, um zu vermeiden, dass sich das buffy Fell mit dem Dichtegradientenmedium vermischt. Sammeln Sie vorsichtig den Anteil der mononukleären Zellen zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem Überstand.
Übertragen Sie das buffy Mantel in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit 10 Milliliter 1X PBS. Zentrifuge bei 300 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen, indem Sie mit fünf Millilitern ACK-Lysepuffer, der den Pelletzellen zugesetzt wird, lysieren.
Vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Zentrifugieren wieder wie zuvor, entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren in 10 Milliliter 1X PBS oder RPMI 1640 medium. Verwenden Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit durch Trypan Blue-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer zu überprüfen.
Typischerweise werden für jeden Milliliter Blut ein bis zwei Millionen Zellen mit mehr als 95% Lebensfähigkeit erhalten. Nach der Zentrifugation wie bisher, entsorgen Sie den Überstand und passen Sie die Zellzahl an die erforderliche Konzentration an. Laden Sie 3,5 Millionen periphere mononukleäre Blutzellen in 200 Mikroliter 1X PBS in eine Spritze mit einer beigefügten Nadel unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank.
Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und halten Sie sie am Schwanz, damit sie das Netz mit sanfter Traktion nach hinten greifen kann. Legen Sie dann den Zeigefinger und den Daumen auf die Schultern des Tieres, das die lockere Haut des Halses packt und den Mittelfinger benutzt, um seinen Rücken zu stabilisieren. Schieben Sie den Mauskopf nach hinten, so dass sein Rücken über seinem Kopf ist.
Dadurch kann die Eingeweide in der Bauchhöhle nach hinten verschoben werden und das Risiko, während der Injektion innere Organe zu durchkreuzen, reduziert werden. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol. Durchdringen Sie die vorbereitete Spritze durch die Bauchwand und aspirieren Sie, bevor Sie die Zellen injizieren.
Wenn Material angesaugt wird, entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie sie. Andernfalls injizieren Sie die Zellen langsam in die intraperitoneale Höhle, bevor Sie die Spritze entfernen und entsorgen. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überprüfen Sie die Transplantation im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie nach drei Wochen nach der Injektion.
Identifizieren Sie Mäuse durch Ohrmarkierungen. Beobachten Sie die Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet werden, zweimal pro Tag nach jedem Eingriff bei klinischen Anzeichen von Not. Fahren Sie dann mit der HIV-Injektion fort, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach der HIV-Injektion ist eine schnelle Zunahme der Plasmaviruslast in der Regel nach zwei bis drei Wochen nach der Infektion sowohl bei den chronischen als auch bei den akuten Modellen mit ähnlicher Kinetik im Reaktivierungsmodell nachweisbar. Die Zunahme der Viruslast fällt mit einem Rückgang des CD4:CD8-Verhältnisses zusammen. Diese Veränderungen werden bei Kontrollmäusen nicht beobachtet.
Bemerkenswert ist, dass im humanisierten PBMC NSG Adult Mouse Modell eine anfängliche Umkehrung des CD4:CD8-Verhältnisses beobachtet und entlang der Überwachungszeit rekonstituiert wird. Wenn HIV-infizierten Mäusen eine antiretrovirale Therapie verabreicht wird, traten eine Unterdrückung der Viruslast sowie eine Erholung im CD4:CD8-Verhältnis erwartungsgemäß auf und erreichten ähnliche Werte wie bei nicht infizierten Kontrollen. Typischerweise wird nach zwei bis drei Wochen Behandlung eine Abnahme der Viruslast und eine Erhöhung des CD4:CD8-Verhältnisses in den chronischen, akuten und Reaktivierungsmodellen beobachtet.
Verwenden Sie die empfohlene Bestrahlungsdosis, um eine tödliche Überdosierung oder Abstoßung transplantierter Zellen zu vermeiden. Durchbohren Sie die Leber während der Injektion nicht vollständig und verwenden Sie Bettwäsche, um Gerüche zu maskieren, die der Damm als fremd wahrnimmt. Diese drei Modelle ermöglichen tests von antiviralen Verbindungen, Anti-HIV-Antikörpern oder anderen biologischen Substanzen, die die Virusreplikation beeinflussen.
Darüber hinaus ermöglichen sie adaptive Transferexperimente für die HIV-Immuntherapie. NSG humanisierte Mäuse können teilweise oder vollständig mit menschlichen Zellen rekonstituiert werden, um auf Krankheitserreger oder Medikamente zu reagieren, was die Komplexität des menschlichen Immunsystems imitiert. Alle grundlegenden biologischen Maßnahmen müssen strikt befolgt werden, da nSG humanisierte Mäuse sowohl mit murinen als auch mit menschlichen Krankheitserregern infiziert werden können, insbesondere in diesem Fall, in dem HIV-Virus manipuliert wird.
