Questa procedura descrive tre modelli di topi immunodifesa umanizzati per lo studio della dinamica dell'infezione da HIV. I topi umanizzati NSG ricapitolano sulle caratteristiche dell'immunità umana. In questo caso, consentendo lo studio dell'infezione cronica, acuta e riattivata dell'HIV in contesti precli clinici.
A dimostrare la procedura di preparazione cellulare sarà Sandra Medina-Moreno, supervisore della ricerca di laboratorio del nostro gruppo. Quando si esegue questa procedura, utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale usa e getta tra cui scrub sterili, guanti, scarpe dedicate, copriscarpe, maschera, occhiali, cofani per capelli e barba e un camice da laboratorio sterile. Per il modello cronico, resuspend un milione di cellule staminali umane CD34+ congelate in 10 millilitri di supporti RPMI 1640 con 10%FBS in un armadio di biosicurezza certificato e mantenere condizioni sterili.
Utilizzare 10 microlitri della sospensione per contare e controllare la vitalità cellulare mediante la colorazione di esclusione Di Trypan Blue in un emocitometro. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 1X PBS freddo alla concentrazione richiesta.
Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione. Strofina la biancheria da letto pulita tra le mani per mascherare qualsiasi altro odore estraneo sui cuccioli riceventi. Quindi metti i cuccioli in una piastra di Petri sterile di 100 millimetri quadrati insieme a una piccola quantità di materiale da letto dalla gabbia dell'allevatore.
Mettere la piastra di Petri in una gabbia di trasporto pulita e quindi posizionare la gabbia in una gabbia di trasporto carboy per proteggere i cuccioli dalla luce diretta e dal rumore. Coprire la gabbia di trasporto con un tampone di copertura per evitare l'esposizione di animali all'ambiente durante il transito verso la sala di irradiazione. Dopo l'anestesia come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per l'innesto tramite iniezione epatica.
Per ridurre al minimo il tempo di ritenuta del topo, lasciare che uno sperimentatore carichi la siringa con la sospensione delle cellule staminali e che il secondo investigatore tenga il cucciolo e somministra l'iniezione. Caricare 50 microlitri della sospensione delle cellule staminali umane CD34+ nella siringa con un ago attaccato sotto l'armadio di biosicurezza certificato. Trattenere i cuccioli con le dita del pollice e dell'indice e pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol.
Utilizzare un angolo di ago poco profondo per fornire 50 microlitri di cellule direttamente nel fegato in modo da non perforare completamente il fegato. Prewarm il piatto utilizzando un tampone riscaldante a infrarossi per roditori a 20 gradi Celsius per garantire che i cuccioli non siano troppo riscaldati. Posizionare i cuccioli sulla piastra di Petri ricoperta di garza sterile per uno o cinque minuti per consentire il recupero.
Immediatamente prima di restituire i cuccioli ai loro genitori, applicare una piccola quantità di mentolo e unguento a base di eucalipto usando il pollice e le dita indice sul muso di entrambi i genitori per evitare cannibalismo o rifiuto dei cuccioli. Controlla le gabbie ogni giorno, alla ricerca di eventuali segni di innesto rispetto alla malattia dell'ospite nei cuccioli come pelle secca, nessuna alimentazione, eruzione cutanea o alopecia. Svezza i cuccioli a tre settimane di età e ospitali in gabbie diverse.
Verificare l'innesto nel sangue periferico mediante citometria a flusso a 14 settimane di età. Viene mostrata una strategia rappresentativa per la valutazione della ricostruzione umana delle cellule CD45+ e della percentuale di cellule CD4+ e CD8+T. Il tasso di successo dell'innesto è compreso tra l'80% e il 100%Utilizzare cellule mononucleari del sangue periferico umano derivate da un donatore sano per il modello acuto o da un paziente infetto da HIV che era sotto terapia antiretrovirale per il modello di riattivazione.
Strato 15 millilitri di sangue intero in cinque millilitri di mezzo gradiente di densità sterile in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifuga a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente senza pause per evitare che il mantello buffy si mescola con il mezzo gradiente di densità. Raccogliere con cura la frazione di cellule mononucleari tra il mezzo gradiente di densità e il supernatante.
Trasferire il mantello buffy su un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di 1X PBS. Centrifugare a 300 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimuovere i restanti globuli rossi lisciviando con cinque millilitri di tampone di lisi ACK aggiunti alle cellule pellettate.
Incubare per quattro minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato di nuovo come prima, scartare il supernatante e resuspend in 10 millilitri di 1X PBS o RPMI 1640 medium. Utilizzare 10 microlitri della sospensione cellulare per contare le cellule e verificare la vitalità della colorazione di esclusione Trypan Blue in un emocitometro.
In genere, da uno a due milioni di cellule sono ottenute per ogni millilitro di sangue con una vitalità superiore al 95%. Dopo la centrifugazione come prima, scartare il supernatante e regolare il numero di cella alla concentrazione richiesta. Caricare 3,5 milioni di cellule mononucleari del sangue periferico in 200 microlitri di 1X PBS in una siringa con un ago attaccato sotto un armadietto di biosicurezza certificato.
Rimuovere il mouse dalla gabbia e tenerlo per la coda in modo che possa afferrare la rete applicando una leggera trazione all'indietro. Quindi posizionare l'indice e il pollice sulle spalle dell'animale afferrando la pelle sciolta del collo e usando il dito medio per stabilizzare la schiena. Far scorrere la testa del mouse all'indietro in modo che la schiena sia sopra la testa.
Ciò consente di spostare i visceri nella cavità addominale all'indietro e riduce il rischio di foratura degli organi interni durante l'iniezione. Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol. Penetrare la siringa preparata attraverso la parete addominale e aspirare prima di iniettare le cellule.
Se un materiale è aspirato, rimuovere la siringa e scartarla. Altrimenti, iniettare lentamente le cellule nella cavità intraperitoneale prima di rimuovere la siringa e scartarla. Riportare l'animale nella sua gabbia e verificare l'innesto nel sangue periferico mediante citometria a flusso a tre settimane dopo l'iniezione.
Identificare i topi con l'etichetta auricolare. Osservare attentamente i topi utilizzati in questi esperimenti, due volte al giorno dopo ogni procedura per i segni clinici di angoscia. Quindi procedere all'iniezione di HIV come descritto nel protocollo di testo.
Dopo l'iniezione di HIV, c'è un rapido aumento della carica virale plasmatica che di solito è rilevabile dopo due o tre settimane dopo l'infezione sia nei modelli cronici che in quello acuto con cinetica simile nel modello di riattivazione. L'aumento della carica virale coincide con una diminuzione del rapporto CD4:CD8. Questi cambiamenti non si osservano nei topi di controllo.
Si noti che, nel modello di mouse adulto PBMC NSG umanizzato, viene osservata e ricostituita un'inversione iniziale del rapporto CD4:CD8 lungo il tempo di monitoraggio. Quando la terapia antiretrovirale viene somministrata ai topi infetti da HIV, si è verificata una soppressione della carica virale e il recupero nel rapporto CD4:CD8, come previsto, raggiungendo livelli simili a quelli dei controlli non infetti. Tipicamente, dopo due o tre settimane di trattamento, si osserva una diminuzione della carica virale e un aumento del rapporto CD4:CD8 nei modelli cronici, acuti e di riattivazione.
Utilizzare la dose di irradiazione raccomandata per evitare il sovradosaggio letale o il rigetto delle cellule trapiantate. Non perforare completamente il fegato durante l'iniezione e utilizzare biancheria da letto per mascherare gli odori che la diga percepirà come estranei. Questi tre modelli consentono di testare composti antivirali, anticorpi anti-HIV o altre sostanze biologiche che influenzano la replicazione virale.
Inoltre, consentono esperimenti di trasferimento adattivo per l'immunoterapia hiv. I topi umanizzati NSG possono essere ricostituiti parzialmente o per intero con cellule umane per rispondere a patogeni o farmaci, imitando la complessità del sistema immunitario umano. Tutte le misure biologiche di base devono essere rigorosamente seguite poiché i topi umanizzati NSG possono essere infettati da agenti patogeni murini e umani, in particolare in questo caso che utilizza la manipolazione del virus HIV.
