הליך זה מתאר שלושה מודלים של עכברים כשל חיסוני אנושי לחקר הדינמיקה של הידבקות ב- HIV. עכברים אנושיים NSG recapitulates על תכונות של חסינות אנושית. במקרה זה, מאפשר את המחקר של כרונית, חריפה, והפעלה מחדש של הידבקות ב- HIV בהגדרות פרה-קליניות.
הפגנת הליך הכנת התא תהיה סנדרה מדינה-מורנו, מפקחת מחקר מעבדה מהקבוצה שלנו. בעת ביצוע הליך זה, השתמש תמיד בציוד מגן אישי חד פעמי כולל קרצוף סטרילי, כפפות, נעליים ייעודיות, כיסויי נעליים, מסכה, משקפי מגן, מצנפות שיער וזקן, ומעיל מעבדה סטרילי. עבור המודל הכרוני, יש להתריע מחדש על מיליון תאי גזע קפואים מסוג CD34+Human ב-10 מיליליטר של מדיית RPMI 1640 עם 10%FBS תחת ארון ביו-בטיחות מוסמך ולשמור על מצבים סטריליים.
השתמש 10 microliters של ההשעיה לספור ולבדוק את הכדאיות התא על ידי טריפאן כחול הדרה כתמים בהמוציטומטר. ואז צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 פעמים g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-PBS 1X קר בריכוז הנדרש.
שמור את התאים על קרח עד הזרקה. לשפשף מצעים נקיים בין הידיים כדי להסוות כל ריח זר אחר על הגורים המטופל. לאחר מכן מניחים גורים לתוך צלחת פטרי סטרילית 100 מילימטר מרובע יחד עם כמות קטנה של חומר מצעים מכלוב המגדל.
שים את צלחת פטרי לתוך כלוב תחבורה נקי ולאחר מכן למקם את הכלוב בכלוב תחבורה Carboy כדי להגן על גורים מפני אור ישיר ורעש. מכסים את כלוב ההובלה עם כרית כיסוי כדי למנוע חשיפה של בעלי חיים לסביבה תוך כדי מעבר לחדר ההקרנה. לאחר הרדמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, היכונו לתריט באמצעות הזרקת כבד.
כדי למזער את זמן ריסון העכבר, תן לחוקר אחד לטעון את המזרק עם ההשעיה של תאי הגזע ויש לי החוקר השני להחזיק את הגור ולנהל את הזריקה. לטעון 50 microliters של CD34 + השעיה תא גזע אנושי לתוך המזרק עם מחט מחוברת תחת ארון biosafety מוסמך. לרסן את הגורים עם אגודל ואצבעות אינדקס ולנקות את אתר ההזרקה עם 70% אלכוהול.
השתמש בזווית מחט רדודה כדי לספק 50 microliters של תאים ישירות לתוך הכבד כדי לא לנקב לחלוטין את הכבד. לפני המלחמה את המנה באמצעות כרית התחממות אינפרא אדום עבור מכרסמים ב 20 מעלות צלזיוס כדי להבטיח את הגורים לא יהיה מחומם יתר על כן. מניחים את הגורים על צלחת פטרי מכוסה גזה סטרילית במשך 1 עד 5 דקות כדי לאפשר התאוששות.
מיד לפני החזרת הגורים להוריהם, יש למרוח כמות קטנה של משחה על בסיס מנתל ואקליפטוס באמצעות האגודל והאצבעות האינדקסיות לחוטם של שני ההורים כדי למנוע קניבליזם או דחייה של הגורים. בדוק כלובים כל יום, מחפש כל סימנים של שתל לעומת מחלה מארחת בגורים כגון עור יבש, ללא האכלה, פריחה, או התקרחות. ליטף את הגורים בגיל שלושה שבועות ולשכן אותם בכלובים שונים.
אמת חריטה בדם ההיקפי על ידי ציטומטריית זרימה בגיל 14 שבועות. מוצגת אסטרטגיית גת מייצגת להערכת שחזור תאים אנושיים מסוג CD45+תאים ואחוז מתאי CD4+ו- CD8+T. שיעור ההצלחה של חריטה הוא בין 80% ל -100%השתמש בתאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי הנגזרים מתורם בריא למודל החריף או מחולה נגוע ב- HIV שהיה תחת טיפול תרופתי למודל ההפעלה מחדש.
שכבה 15 מיליליטר של דם שלם בחמישה מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות סטרילית לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקות, כדי למנוע את המעיל באפי מלהיות מעורבב עם מדיום שיפוע צפיפות. בזהירות לאסוף את השבר של תאים mononuclear בין המדיום שיפוע צפיפות על טבעי.
מעבירים את מעיל באפי לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 1X PBS. צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant ולהסיר את תאי הדם האדומים הנותרים על ידי lysing עם חמישה מיליליטר של מאגר תזה ACK הוסיף לתאים גלולה.
דגירה במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה שוב כמו קודם, להשליך את supernatant ו resuspend ב 10 מיליליטר של 1X PBS או RPMI 1640 בינוני. השתמש 10 microliters של ההשעיה התא לספור את התאים ולבדוק את הכדאיות על ידי טריפאן כחול הדרה כתמים בהמוציטומטר.
בדרך כלל, אחד עד שני מיליון תאים מתקבלים עבור כל מיליליטר אחד של דם עם יותר מ 95%הכדאיות. לאחר צנטריפוגה כבעבר, השלך את העל-טבעי והתאם את מספר התא לריכוז הנדרש. לטעון 3.5 מיליון תאי מונונוקלאר דם היקפיים ב 200 microliters של 1X PBS לתוך מזרק עם מחט מחוברת תחת ארון biosafety מוסמך.
הסר את העכבר מהכלוב והחזק אותו בזנב כך שיוכל לאחוז את רשת שינוי החלת מתיחה עדינה לאחור. לאחר מכן מניחים את האצבע והאגודל על כתפי החיה שתופסים את העור הרופף של הצוואר ומשתמשים באצבע האמצעית כדי לייצב את גבה. החלק את ראש העכבר לאחור כך שגבו יהיה מעל ראשו.
זה מאפשר הקרביים בחלל הבטן להיות נעקר לאחור ומפחית את הסיכון של ניקוב איברים פנימיים במהלך ההזרקה. נקה את אתר ההזרקה עם 70% אלכוהול. לחדור את המזרק מוכן דרך דופן הבטן ולספירה לפני הזרקת התאים.
אם חומר כלשהו הוא שאפו, להסיר את המזרק ולהשליך אותו. אחרת, להזריק את התאים לאט בחלל תוך-אפית לפני הסרת המזרק והשליכתו. להחזיר את החיה לכלוב שלה ולאמת חריטה בדם היקפי על ידי ציטומטריה זרימה בשלושה שבועות לאחר ההזרקה.
זהה עכברים על-ידי תיוג אוזניים. שימו לב לעכברים המשמשים בניסויים אלה מקרוב, פעמיים ביום לאחר כל הליך לסימנים קליניים של מצוקה. לאחר מכן המשיכו להזרקת HIV כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
בעקבות הזרקת HIV, יש עלייה מהירה בעומס נגיפי פלזמה בדרך כלל להיות מזוהה לאחר שבועיים עד שלושה שבועות לאחר ההדבקה הן במודלים כרוניים חריפים עם קינטיקה דומה במודל ההפעלה מחדש. העלייה בעומס הנגיפי עולה בקנה אחד עם ירידה ביחס CD4:CD8. שינויים אלה אינם נצפו בעכברי בקרה.
שים לב, בדגם העכבר הבוגר PBMC NSG האנושי, היפוך ראשוני של יחס CD4:CD8 נצפה ושוחזר לאורך זמן הניטור. כאשר טיפול אנטי-רטרו-ויראלי מנוהל לעכברים נגועים ב- HIV, דיכוי של העומס הנגיפי כמו גם התאוששות ביחס CD4:CD8 התרחשו כצפוי והגיעו לרמות דומות לאלה בפקדים לא נגועים. בדרך כלל, לאחר שבועיים עד שלושה שבועות של טיפול, ירידה בעומס נגיפי וגידול ביחס CD4:CD8 נצפתה במודלים הכרוניים, החריפים וההפעלה מחדש.
השתמש במינון ההקרנה המומלץ כדי למנוע מנת יתר קטלנית או דחייה של תאים מושתלים. אין לנקב לחלוטין את הכבד במהלך ההזרקה ולהשתמש במצעים כדי להסוות ריחות שהסכר יתפוס כזרים. שלושת המודלים הללו מאפשרים בדיקה של תרכובות אנטי ויראליות, נוגדנים נגד HIV או חומרים ביולוגיים אחרים המשפיעים על שכפול ויראלי.
בנוסף, הם מאפשרים ניסויי העברה אדפטיבית עבור אימונותרפיה HIV. עכברים אנושיים NSG ניתן reconstituted באופן חלקי או מלא עם תאים אנושיים להגיב פתוגנים או תרופות, מחקה את המורכבות של המערכת החיסונית האנושית. כל האמצעים הביולוגיים הבסיסיים צריכים להיות במעקב קפדני מאז עכברים אנושיים NSG יכול להיות נגוע הן מורין פתוגנים אנושיים, במיוחד במקרה זה המשתמשת מניפולציה וירוס HIV.
