Эта процедура описывает три модели гуманизированных иммунодефицитных мышей для изучения динамики ВИЧ-инфекции. NSG гуманизированных мышей recapitulates на особенности человеческого иммунитета. В этом случае допускается изучение хронической, острой и возобновленной ВИЧ-инфекции в доклинических условиях.
Демонстрация процедуры подготовки клеток будет Сандра Медина-Морено, руководитель лабораторных исследований из нашей группы. При выполнении этой процедуры, всегда используйте одноразовые средства индивидуальной защиты, включая стерильные скрабы, перчатки, специальную обувь, бахилы, маску, очки, волосы и бороду капоты, и стерильные пальто лаборатории. Для хронической модели, resuspend один миллион замороженных CD34 "человеческих стволовых клеток в 10 миллилитров RPMI 1640 средств массовой информации с 10%FBS под сертифицированным шкафом биобезопасности и поддерживать стерильные условия.
Используйте 10 микролитров подвески для подсчета и проверки жизнеспособности клеток с помощью trypan Blue исключения окрашивания в гемоцитометре. Затем центрифугировать подвеску клетки при 400 раз г в течение 15 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и повторно посовекуйте клетки в холодном 1X PBS при необходимой концентрации.
Держите клетки на льду до инъекции. Руб чистые постельные принадлежности между руками, чтобы замаскировать любые другие иностранные запахи на щенках получателя. Затем поместите щенков в стерильную чашку Петри площадью 100 квадратных миллиметров вместе с небольшим количеством материала для постельных принадлежностей из клетки заводчика.
Положите чашку Петри в чистую транспортную клетку, а затем поместите клетку в транспортную клетку Carboy, чтобы защитить щенков от прямого света и шума. Обложка транспортной клетке с крышкой площадку, чтобы избежать воздействия животных на окружающую среду во время транзита в комнату облучения. После анестезии, как описано в текстовом протоколе, подготовьтесь к энграфтированию с помощью печеночным путем инъекций.
Чтобы свести к минимуму время мыши сдержанность, пусть один следователь загрузить шприц с подвеской стволовых клеток и второй следователь держать щенка и управлять инъекцией. Загрузите 50 микролитров подвески стволовой клетки CD34 в шприц с прикрепленной иглой под сертифицированным шкафом биобезопасности. Сдерживайте щенков большим и указательным пальцами и очистите место инъекции 70%-ным алкоголем.
Используйте неглубокий угол иглы, чтобы доставить 50 микролитров клеток непосредственно в печень, чтобы не полностью проколоть печень. Довоенная тарелка с помощью инфракрасного потепления площадку для грызунов при 20 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить щенков не будет более нагревается. Поместите щенков на чашку Петри, покрытую стерильной марлей в течение одной-пяти минут, чтобы дать выздоровление.
Непосредственно перед возвращением щенков к родителям, применить небольшое количество ментол и эвкалипта основе мази с помощью большого пальца и указательных пальцев морду обоих родителей, чтобы избежать каннибализма или отказ от щенков. Проверьте клетки каждый день, ищет какие-либо признаки трансплантата по сравнению с принимающей болезни у щенков, таких как сухая кожа, не кормления, сыпь, или облысение. Отучат щенков в возрасте трех недель и развямим их в разных клетках.
Проинструйте присвещение периферической крови цитометрией потока в возрасте 14 недель. Показана репрезентативная стратегия для оценки реконструкции клеток CD45 и процентной доли клеток CD4 и CD8.T. Успешность приразражания составляет от 80%до 100% Использование моноядерных клеток периферической крови человека, полученных от здорового донора для острой модели или вич-инфицированного пациента, который был под антиретровирусной терапии для модели реактивации.
Слой 15 миллилитров цельной крови в пяти миллилитров стерильной плотности градиента среды в 50 миллилитров конической трубки. Центрифуга в 400 раз g в течение 30 минут при комнатной температуре без перерывов, чтобы избежать баффи пальто от смешивания с плотностью градиента среды. Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток между градиентом плотности и супернатантом.
Перенесите баффи пальто на 15 миллилитровую центрифугу, содержащую 10 миллилитров 1X PBS. Центрифуга при температуре 300 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и удалите оставшиеся красные кровяные тельца, облизав пять миллилитров буфера лиза ACK, добавленного в гранулы клеток.
Инкубировать в течение четырех минут при комнатной температуре. После центрифугирования снова, как и прежде, отказаться от супернатанта и повторного перерасхода в 10 миллилитров 1X PBS или RPMI 1640 среды. Используйте 10 микролитров клеточной подвески для подсчета клеток и проверки жизнеспособности trypan Blue исключения окрашивания в гемоцитометре.
Как правило, на каждый миллилитр крови с более чем 95%-ной жизнеспособностью получается от одного до двух миллионов клеток. После центрифугации, как и прежде, отбросьте супернатант и отрегулируйте номер клетки к требуемой концентрации. Загрузите 3,5 миллиона периферических моноядерных клеток крови в 200 микролитров 1X PBS в шприц с прикрепленной иглой под сертифицированным шкафом биобезопасности.
Удалите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она можно схватить сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательный палец и большой палец на плечи животного захвата свободной кожи шеи и с помощью среднего пальца, чтобы стабилизировать его спину. Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой.
Это позволяет внутренности в брюшной полости, чтобы быть перемещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции. Очистите место инъекций 70%-м алкоголем. Проникнете в подготовленный шприц через брюшную стенку и аспират перед введением клеток.
Если какой-либо материал аспирирован, удалите шприц и отбросьте его. В противном случае, вводить клетки медленно во внутриперитонеальной полости, прежде чем удалить шприц и отбрасывая его. Верните животное в клетку и проинструйте присвещение периферической крови путем цитометрии потока через три недели после инъекции.
Определите мышей по маркировке ушей. Наблюдайте за мышами, используемыми в этих экспериментах внимательно, два раза в день после каждой процедуры для клинических признаков бедствия. Затем приступайте к инъекциям ВИЧ, как описано в текстовом протоколе.
После инъекций ВИЧ происходит быстрое увеличение плазменной вирусной нагрузки, обычно обнаруживаемой после двух-трех недель после инфицирования как в хронических, так и в острых моделях с аналогичной кинетикой в модели реактивации. Увеличение вирусной нагрузки совпадает со снижением соотношения CD4:CD8. Эти изменения не наблюдаются у контрольных мышей.
Следует отметить, что в гуманизированной модели мыши PBMC NSG для взрослых наблюдается и восстановлена начальная инверсия соотношения CD4:CD8 в течение всего времени мониторинга. Когда антиретровирусная терапия проводится ВИЧ-инфицированным мышам, подавление вирусной нагрузки, а также восстановление в соотношении CD4:CD8 произошло, как ожидалось, достигнув аналогичных уровней, чем в неинфицированных контроля. Как правило, после двух-трех недель лечения, снижение вирусной нагрузки и увеличение соотношения CD4:CD8 наблюдается в хронических, острых и реактивации моделей.
Используйте рекомендуемую дозу облучения, чтобы избежать смертельной передозировки или отторжения пересаженных клеток. Не полностью проколоть печень во время инъекции и использовать постельные принадлежности, чтобы замаскировать запахи, которые плотина будет воспринимать как иностранные. Эти три модели позволяют тестировать противовирусные соединения, анти-ВИЧ антитела или другие биологические вещества, которые влияют на репликацию вируса.
Кроме того, они позволяют провести адаптивные трансферные эксперименты для иммунотерапии ВИЧ. НСГ гуманизированных мышей могут быть восстановлены частично или в полном объеме с человеческими клетками, чтобы реагировать на патогенные микроорганизмы или препараты, имитируя сложность иммунной системы человека. Все основные биологические меры должны строго соблюдаться, так как гуманизированные мыши NSG могут быть инфицированы как мурином, так и патогенными микроорганизмами человека, особенно в этом случае, который использует манипуляции с вирусом ВИЧ.
