Este procedimento descreve três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para o estudo da dinâmica da infecção pelo HIV. Ratos humanizados NSG recapitulam características de imunidade humana. Neste caso, permitindo o estudo da infecção crônica, aguda e reativada do HIV em ambientes pré-clínicos.
Demonstrando o procedimento de preparação celular estará Sandra Medina-Moreno, supervisora de pesquisa laboratorial do nosso grupo. Ao realizar este procedimento, use sempre equipamentos de proteção pessoal descartáveis, incluindo esfoliantes estéreis, luvas, sapatos dedicados, capas de sapato, máscara, óculos, capô de cabelo e barba, e um jaleco estéril. Para o modelo crônico, resuspenque um milhão de células-tronco CD34+humanas congeladas em 10 mililitros de mídia RPMI 1640 com 10% de FBS sob um armário de biossegurança certificado e mantenha condições estéreis.
Use 10 microliters da suspensão para contar e verificar a viabilidade celular pela mancha de exclusão trypan blue em um hemócito. Em seguida, centrifufique a suspensão da célula a 400 vezes g por 15 minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernasciente e resuspenque as células no frio 1X PBS na concentração necessária.
Mantenha as células no gelo até a injeção. Esfregue a roupa de cama limpa entre as mãos para mascarar quaisquer outros odores estranhos nos filhotes receptores. Em seguida, coloque os filhotes em uma placa de Petri de 100 milímetros quadrados estéril, juntamente com uma pequena quantidade de material de cama da gaiola do criador.
Coloque a placa de Petri em uma gaiola de transporte limpo e, em seguida, coloque a gaiola em uma gaiola de transporte Carboy para proteger os filhotes da luz direta e do ruído. Cubra a gaiola de transporte com uma almofada de cobertura para evitar a exposição dos animais ao ambiente enquanto estiver em trânsito para a sala de irradiação. Após a anestesia, conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para o enxerto por injeção hepática.
Para minimizar o tempo de contenção do rato, deixe um investigador carregar a seringa com a suspensão das células-tronco e fazer com que o segundo investigador segure o filhote e administre a injeção. Carregue 50 microliters da suspensão de células-tronco CD34+humanas na seringa com uma agulha anexada sob o armário de biossegurança certificado. Contenha os filhotes com polegar e dedos indicadores e limpe o local da injeção com 70% de álcool.
Use um ângulo de agulha raso para entregar 50 microliters de células diretamente no fígado para não perfurar completamente o fígado. Pré-aqueça o prato usando uma almofada de aquecimento infravermelho para roedores a 20 graus Celsius para garantir que os filhotes não serão mais aquecidos. Coloque os filhotes na placa de Petri coberta com gaze estéril por um a cinco minutos para permitir a recuperação.
Imediatamente antes de devolver os filhotes aos seus pais, aplique uma pequena quantidade de pomada à base de mentol e eucalipto usando o polegar e os dedos indicadores no focinho de ambos os pais para evitar o canibalismo ou a rejeição dos filhotes. Verifique as gaiolas todos os dias, procurando qualquer sinal de enxerto versus doença hospedeira nos filhotes, como pele seca, sem alimentação, erupção cutânea ou alopecia. Desmamar os filhotes com três semanas de idade e casá-los em gaiolas diferentes.
Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo aos 14 semanas de idade. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação da reconstrução celular CD45+e percentual de células CD4+e CD8+T é mostrada. A taxa de sucesso do enxerto é entre 80% a 100% Uso de células mononucleares de sangue periféricos humanos derivadas de um doador saudável para o modelo agudo ou de um paciente infectado pelo HIV que estava sob terapia antirretroviral para o modelo de reativação.
Camada 15 mililitros de sangue inteiro em cinco mililitros de gradiente de densidade estéril em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente sem pausas para evitar que o casaco buffy fique misturado com o meio gradiente de densidade. Colete cuidadosamente a fração de células mononucleares entre o gradiente de densidade médio e o sobrenante.
Transfira o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 1X PBS. Centrifugar a 300 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernascimento e remova os glóbulos vermelhos restantes, lise com cinco mililitros de tampão de lise ACK adicionados às células pelladas.
Incubar por quatro minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifuging novamente como antes, descarte o supernaspe e resuspend em 10 mililitros de 1X PBS ou RPMI 1640 médio. Use 10 microliters da suspensão celular para contar as células e verificar a viabilidade pela mancha de exclusão trypan blue em um hemótmetro.
Normalmente, de um a dois milhões de células são obtidas para cada um mililitro de sangue com mais de 95% de viabilidade. Após a centrifugação como antes, descarte o sobrenante e ajuste o número da célula à concentração necessária. Carregue 3,5 milhões de células mononucleares de sangue periféricos em 200 microliters de 1X PBS em uma seringa com uma agulha presa sob um armário de biossegurança certificado.
Retire o mouse da gaiola e segure-o pela cauda para que ele possa segurar a malha aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o dedo indicador e o polegar sobre os ombros do animal agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar suas costas. Deslize a cabeça do mouse para trás para que suas costas estão acima de sua cabeça.
Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfurar órgãos internos durante a injeção. Limpe o local da injeção com 70% de álcool. Penetre a seringa preparada através da parede abdominal e aspire antes de injetar as células.
Se algum material estiver aspirado, remova a seringa e descarte-a. Caso contrário, injete as células lentamente na cavidade intraperitoneal antes de remover a seringa e descartá-la. Devolva o animal à sua gaiola e verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo em três semanas após a injeção.
Identifique ratos por marcação de ouvido. Observe os camundongos utilizados nesses experimentos de perto, duas vezes por dia após cada procedimento para sinais clínicos de angústia. Em seguida, proceda à injeção de HIV, conforme descrito no protocolo de texto.
Após a injeção do HIV, há um rápido aumento da carga viral plasmática geralmente sendo detectável após duas a três semanas após a infecção em ambos os modelos crônicos e agudos com cinética semelhante no modelo de reativação. O aumento da carga viral coincide com uma diminuição na proporção CD4:CD8. Essas alterações não são observadas em camundongos de controle.
Note-se que, no modelo humanizado de mouse adulto PBMC NSG, observa-se uma inversão inicial da razão CD4:CD8 e reconstituída ao longo do tempo de monitoramento. Quando a terapia antirretroviral é administrada em camundongos infectados pelo HIV, a supressão da carga viral, bem como a recuperação na razão CD4:CD8 ocorreram como esperado atingindo níveis semelhantes aos dos que não foram infectados. Normalmente, após duas a três semanas de tratamento, observa-se uma diminuição da carga viral e aumento da razão CD4:CD8 nos modelos crônicos, agudos e de reativação.
Use a dose de irradiação recomendada para evitar overdose letal ou rejeição de células transplantadas. Não fure completamente o fígado durante a injeção e use roupa de cama para mascarar odores que a barragem vai perceber como estranho. Esses três modelos permitem o teste de compostos antivirais, anticorpos anti-HIV ou outras substâncias biológicas que afetam a replicação viral.
Além disso, permitem experimentos de transferência adaptativa para a imunoterapia do HIV. Camundongos humanizados NSG podem ser reconstituídos parcial ou integralmente com células humanas para responder a patógenos ou drogas, imitando a complexidade do sistema imunológico humano. Todas as medidas biológicas básicas precisam ser rigorosamente seguidas, uma vez que os camundongos humanizados do NSG podem ser infectados com patógenos murinos e humanos, particularmente neste caso que usa manipulação do vírus HIV.
