Эндометрий является тканью, которая меняется каждый месяц в ответ на гормоны. Гормональный дисбаланс может предотвратить вложение эмбриона, а также вызвать такие заболевания, как рак. Наш протокол восстанавливает эндометрий так, чтобы его можно было изучать вне тела женщины физиологически.
Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает 3D структуру клеток, состоящий из двух гормонально отзывчивых типов клеток, эпителиальных и стромных клеток, которые специально организуют и ведут себя так, как они делают в организме. Так как органоиды могут лучше имитировать поведение тканей, они могут в конечном итоге быть использованы для тестирования различных препаратов. Органоиды эндометрия могут быть использованы для изучения прямого воздействия известных в настоящее время факторов риска развития рака, включая ожирение и синдром поликистозных яичников.
Наши органоиды подчеркивают важность паракринных действий между двумя типами клеток. Важно начать с достаточного количества тканей. Получение правильной плотности эпителиальных и стромальных клеток может быть сложно.
Кроме того, органоиды довольно малы и может быть трудно визуализировать с IHC окрашивания. Визуализация этой процедуры важна, потому что есть некоторые шаги, которые будет гораздо легче понять, увидев их. К ним относятся получение правильного слоя ткани матки, получение правильной плотности клеток, чтобы объединить, и посева агарозы формы.
Перед началом изоляции клеток, литые и эквилибрировать 1,5%agarose микро-формы в соответствии с инструкциями производителя для дома органоидов. В кабинете биобезопасности используйте асептические методы для подготовки ферментного раствора при 37 градусах Цельсия и стерильного фильтра раствора с помощью фильтра шприца 0,2 микрометра в 15-миллилитровую коническую трубку. Используя скальпель, соскребать эндометрий из биопсии матки и фарш ткани на очень мелкие кусочки.
Поместите свежевырубленную ткань в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую ферментный раствор. Закройте крышку и оберните верхнюю часть трубки восковой пленкой, чтобы предотвратить загрязнение. Поместите трубку в ванну для воды или инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут с нежно встряхивания.
После этого сложите 100-микрон-клеточный ситечко поверх 20-микрон-клеточного ситечко на 50-миллилитровую коническую трубку. Фильтр раствор через два ситечко. Промыть 15-миллилитровую коническую трубку с HBSS и положить эту мыть через ситечко, чтобы убедиться, что все клетки собраны.
Затем переверните 20-микрон-клеточный ситечко на новую 50-миллилитровую коническую трубку и смойте эпителиальные клетки с ситечком с 20 миллилитров органоидных средств, дополненных 1%пенициллином и стрептомицином. Центрифуга конических труб при 500 Г в течение пяти минут. Для собранных стромальных клеток удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 10 миллилитров буфера лиза красных кровяных телец.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10-15 минут. Центрифуга этих клеток при 500 Г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы с 200 до 300 микролитров органоидных средств массовой информации.
Для собранных эпителиальных клеток удалите супернатант и повторно наполните гранулы в 100 микролитров органоидных средств массовой информации. После 1.5%agarose формы equilibrated, удалить органоидные средства массовой информации на внешней стороне агарозы формы и наклона ткани культуры пластины так, что среда из камеры посева клеток блюда агарозы также могут быть тщательно удалены. Просмотр эпителиальных и стромальных клеточных суспензий под микроскопом и добавить больше органоидных средств массовой информации для суспензий, убедившись, что добавить только 100 микролитров в то время, так что подвеска примерно равны по плотности.
Затем объединить одну часть стромальных клеток с тремя частями эпителиальных клеток по объему. Пипетка 50 микролитров комбинированной клеточной подвески в камеру посева клетки агарозной формы. После того, как агароза формы заполнены клетками, осторожно добавить 400 микролитров свежих органоидных средств массовой информации в колодцы 24-хорошо пластины.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа, убедившись, что изменить средний каждый второй день с 500 микролитров органоидных средств массовой информации. Через семь дней, изменить средний до одного, который дополняется 0,1 наномолярного эстрадиола и 0,8 наномолярного тестостерона для содействия организации эпителиальных и стромальных клеток. Во-первых, растворить 1.5%agarose в PBS путем кипячения.
Поместите жидкую агарозу в стакан горячей воды и дайте ей остыть примерно до 50 градусов по Цельсию. Под рассечением микроскопа, наклонить 24-хорошо пластины и тщательно пипетки из среды с внешней стороны формы агарозы. Затем осторожно пипетка из среды из интерьера формы агарозы, чтобы избежать нарушения органоидов.
Аккуратно добавьте от 70 до 75 микролитров теплого, 1,5%агарозы в камеру блюда агарозы, будьте осторожны, чтобы не беспокоить органоиды. Дайте пластине остыть при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. После этого, добавить 4%paraformaldehyde в каждый колодец из 24-хорошо пластины и исправить всю запечатанную форму агарозы на ночь при четырех градусах по Цельсию.
На следующий день, хранить пластины в 70% этанола при четырех градусах по Цельсию, пока не готовы к обработке для встраивания парафина. Чтобы начать изоляцию РНК, просмотрите пластину под рассеченным микроскопом. Наклоните пластину и тщательно пипетка из среды из камеры агарозы формы.
Насильно пипетка один миллилитр свежей органоидной среды непосредственно в агаросовую форму так, чтобы органоиды вымылись из микроуровн, будучи осторожными, чтобы не создавать слишком много пузырьков. Повторите этот силовой процесс пипетки один раз с помощью той же среды. После этого соберите все среды, содержащие органоиды.
Центрифуга на 500 Г, чтобы собрать органоиды, и приступить к экстракции РНК. В этом исследовании органоиды эндометрия человека, состоящие из эпителиальных и стромальных клеток эндометрия, генерируются без использования экзогенных эшафотовых материалов. Для гистологической обработки, агароза формы, содержащие органоиды эндометрия запечатаны агарозой, а затем фиксации с 4%paraformaldehyde ночь.
Эти формы обрабатываются для стандартного встраивания парафина секционированы и окрашены для гистологии, иммунофторесценции, или иммуногистохимии. Гематоксилин в окрашивании эозином показывает сфероидную структуру с одним слоем клеток, выстилающих внешнюю сторону и клетки в центре. Клеточные маркеры для эндометрия, эпителиальных и стромальных клеток показывают эпителиальные клетки, окружающие органоиды с стромальными клетками в центре.
Маркеры физиологии эндометрия подтверждают, что органоиды эндометрия сохранили определенные характеристики родной ткани. Трихомральное окрашивание, которое окрашивает коллагеновый синий цвет и клетки красного цвета, показывает наличие коллагена в центре, где проживали стромальные клетки, демонстрируя активное производство и секрецию коллагена стромальными клетками, похожими на родную ткань. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание выявляет наличие рецепторов эстрогена, рецепторов андрогенов и рецепторов прогестерона как в эпителиальных, так и в стромальных клетках.
Важно плотно потрохать клетки так, чтобы у нас было достаточно органоидов для экспериментов ниже по течению. Это займет некоторую практику. Органоиды эндометрия могут быть выучены в различных условиях, а затем собраны для экспериментов, таких как иммуногистохимия или иммунофлуоресценция окрашивания для изучения экспрессии белка или собраны для РНК для изучения экспрессии генов.
Наша лаборатория исследует, как эндометрий реагирует на измененные уровни гормонов, что может привести к гиперплазии эндометрия и раку. Мы можем использовать эти органоиды для долгосрочного лечения гормонов и добавить патологических состояний, таких как избыток тестостерона в синдроме поликистозных яичников, или сигналы от адипоцитов для изучения ожирения индуцированных изменений эндометрия. Человеческие ткани считаются биологически случайными, и важно принять соответствующие меры предосторожности.
