Das Endometrium ist ein Gewebe, das sich jeden Monat als Reaktion auf Hormone ändert. Hormonungleichgewicht kann die Anhaftung von Embryonen verhindern und auch Krankheiten wie Krebs verursachen. Unser Protokoll baut das Endometrium wieder auf, so dass es außerhalb des Körpers der Frau auf physiologische Weise untersucht werden kann.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine 3D-Struktur von Zellen bietet, die aus zwei hormonell reagierenden Zelltypen bestehen, den epitheliaalen und stroma Zellen, die sich spezifisch organisieren und verhalten, wie sie es im Körper tun. Da die Organoide das Gewebeverhalten besser imitieren können, können sie schließlich verwendet werden, um verschiedene Medikamente zu testen. Die endometrialen Organoide können verwendet werden, um direkte Auswirkungen der derzeit bekannten Risikofaktoren für Krebs zu untersuchen, einschließlich Fettleibigkeit und polyzystischem Ovarialsyndrom.
Unsere Organoide betonen die Bedeutung parakriner Aktionen zwischen zwei Zelltypen. Es ist wichtig, mit einer ausreichenden Menge an Gewebe zu beginnen. Es kann schwierig sein, die richtige Dichte von Epithel- und Stromalzellen zu erhalten.
Auch die Organoide sind recht klein und können mit IHC-Färbung schwer zu visualisieren sein. Die Visualisierung dieses Verfahrens ist wichtig, da es einige Schritte gibt, die nach dem Sehen viel leichter zu verstehen sind. Dazu gehören immer die richtige Gewebeschicht der Gebärmutter, immer die richtige Dichte der Zellen zu kombinieren, und Saat der Agarose Formen.
Vor Beginn der Zellisolierung 1,5% Agarose-Mikroformen nach den Anweisungen des Herstellers zur Unterbringung der Organoide gießen und ausdemieren. Verwenden Sie in einem Biosicherheitsschrank aseptische Techniken, um eine Enzymlösung bei 37 Grad Celsius herzustellen und die Lösung mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter in ein 15-Milliliter-Konusrohr zu filtern. Mit einem Skalpell Endometrium aus den Gebärmutterbiopsien abkratzen und das Gewebe in sehr kleine Stücke zerkleinern.
Legen Sie das frisch gehackte Gewebe in die 15-Milliliter-Konustube, die die Enzymlösung enthält. Schließen Sie die Kappe und wickeln Sie die Oberseite des Rohres mit einem Wachsfilm, um eine Kontamination zu verhindern. Legen Sie die Röhre 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln in ein Wasserbad oder einen Inkubator.
Danach stapeln Sie ein 100-Mikron-Zellsieb auf einem 20-Mikrometer-Zellsieb auf einem 50-Milliliter-Konustube. Filtern Sie die Lösung durch die beiden Siebe. Spülen Sie das 15-Milliliter-Konische Rohr mit HBSS und legen Sie diese Wäsche durch das Sieb, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden.
Dann invertieren Sie das 20-Mikron-Zellsieb auf ein neues 50-Milliliter-Konikonrohr und waschen Sie die Epithelzellen vom Sieb mit 20 Milliliterorganoiden Medien, ergänzt mit 1%Penicillin und Streptomycin. Zentrifugieren Sie die konischen Rohre bei 500 G für fünf Minuten. Für die gesammelten Stromalzellen den Überstand entfernen und das Pellet in 10 Millilitern roter Blutkörperchenlysepuffer wieder aufsetzen.
Bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie diese Zellen bei 500 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 200 bis 300 Mikroliterorganoidmedien wieder auf.
Für gesammelte Epithelzellen, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter organoiden Medien aus. Nachdem die 1,5%agarose Formen ausgeglichen sind, entfernen Sie die Organoidmedien an der Außenseite der Agaroseformen und neigen Sie die Gewebekulturplatte, so dass auch das Medium aus der Zellsäkammer der Agarose-Gerichte vorsichtig entfernt werden kann. Sehen Sie sich die epithelialen und stromalen Zellsuspensionen unter dem Mikroskop an und fügen Sie den Suspensionen weitere organoide Medien hinzu, sodass Sie nur 100 Mikroliter gleichzeitig hinzufügen, sodass die Suspension in etwa gleich dicht ist.
Kombinieren Sie dann einen Teil der Stromalzellen mit drei Teilen der Epithelzellen nach Volumen. Pipette 50 Mikroliter der kombinierten Zellsuspension in die Zellsäkammer der Agaroseform. Sobald die Agarose-Formen mit Zellen gefüllt sind, fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter frische organoide Medien in die Brunnen der 24-Well-Platte.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass das Medium jeden zweiten Tag mit 500 Mikroliter organoiden Medien zu ändern. Nach sieben Tagen, ändern Sie das Medium in ein, das mit 0,1 Nanomolar Estradiol und 0,8 Nanomolar Testosteron ergänzt wird, um die Organisation der Epithel- und Stromalzellen zu fördern. Lösen Sie zunächst 1,5% Agarose in PBS durch Kochen auf.
Die flüssige Agarose in ein Becherglas mit heißem Wasser geben und auf ca. 50 Grad Celsius abkühlen lassen. Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie das Medium vorsichtig von der Außenseite der Agaroseform heraus. Dann pipette sorgfältig das Medium aus dem Inneren der Agarose Schimmel, um zu vermeiden, stören die Organoide.
Zwischen 70 und 75 Mikroliter warme, 1,5%Agarose vorsichtig in die Kammer der Agaroseschale geben, wobei darauf zu achten ist, die Organoide nicht zu stören. Lassen Sie die Platte bei vier Grad Celsius für fünf Minuten abkühlen. Danach 4% Paraformaldehyd in jeden Brunnen der 24-Well-Platte geben und die gesamte versiegelte Agaroseform über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren.
Am nächsten Tag lagern Sie die Platte in 70% Ethanol bei vier Grad Celsius, bis sie für die Paraffineinbettung bereit ist. Um mit der RNA-Isolation zu beginnen, sehen Sie sich die Platte unter einem Sezierendes Mikroskop an. Kippen Sie die Platte und pipette vorsichtig aus dem Medium aus der Kammer der Agarose Schimmel.
Kraftvoll pipette einen Milliliter frisches organoides Medium direkt in die Agarose-Form, so dass die Organoide aus den Mikrobrunnen gespült werden, wobei darauf achten, nicht zu viele Blasen zu erzeugen. Wiederholen Sie diesen kraftvollen Pipettiervorgang, sobald Sie dasselbe Medium verwenden. Danach sammeln Sie das gesamte Medium, das die Organoide enthält.
Zentrifuge bei 500 G, um die Organoide zu sammeln, und gehen Sie zur RNA-Extraktion. In dieser Studie werden menschliche Endometrium-Organoide, die aus epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums bestehen, ohne die Verwendung von exogenen Gerüstmaterialien erzeugt. Für die histologische Verarbeitung werden die Agaroseformen, die die Endometrium-Organoide enthalten, mit Agarose versiegelt, gefolgt von einer Fixierung mit 4% Paraformaldehyd über Nacht.
Diese Formen werden für Standard-Paraffin-Einbettungen für Histologie, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie verarbeitet. Das Hämatoxylin in der Eosinfärbung zeigt eine sphäroidartige Struktur mit einer einzigen Zellschicht, die die Außenseite und die Zellen in der Mitte auskundet. Zellspezifische Marker für Endometrium-, Epithel- und Stromalzellen zeigen Epithelzellen, die das Organoid mit Stromalzellen in der Mitte umgeben.
Marker der endometrialen Physiologie bestätigen, dass die Endometrium-Organoide bestimmte Eigenschaften des nativen Gewebes beibehalten haben. Die Trichrome-Färbung, die Kollagenblau und Zellen rot färbt, zeigt das Vorhandensein von Kollagen in der Mitte, in der sich Stromalzellen residierten, und demonstriert eine aktive Produktion und Sekretion von Kollagen durch Stromalzellen, die dem nativen Gewebe ähneln. Darüber hinaus zeigt immunhistochemische Färbung das Vorhandensein von Östrogen-Rezeptoren, Androgen-Rezeptoren, und Progesteron-Rezeptoren in den epitheliale und stromalen Zellen.
Es ist wichtig, die Zellen dicht zu bedecken, damit wir genügend Organoide für nachgelagerte Experimente haben. Dies wird einige Praxis in Anspruch nehmen. Endometriale Organoide können unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und dann für Experimente wie Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung geerntet werden, um die Proteinexpression zu untersuchen, oder für RNA geerntet werden, um die Genexpression zu untersuchen.
Unser Labor untersucht, wie das Endometrium auf veränderte Hormonspiegel reagiert, was zu endometriender Hyperplasie und Krebs führen kann. Wir können diese Organoide für langfristige Behandlungen von Hormonen verwenden und pathologische Bedingungen wie überschüssiges Testosteron im polyzystischen Ovarialsyndrom oder Signale von Adipozyten hinzufügen, um Adipositas-induzierte Endometriumveränderungen zu untersuchen. Menschliches Gewebe gilt als biogefährlich, und es wird wichtig sein, geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.
