Floxed الكاسيت الالاتليك تبادل الطفرات هو وسيلة هامة لأن حذف الجينات هو أداة قيمة التي يمكن استخدامها لفهم وظيفة المنتجات الجينية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بحذف الجينات المستهدفة دون إلحاق تأثيرات قطبية على جينات المصب. تحديد ما يقرب من ثلاث مناطق كيلوبيس مباشرة من المنبع والمصب من الجين المستهدف للحذف لتكون بمثابة خمسة الرئيسية وأذرع homology الرئيسية لإعادة التركيب المتجانسة وتعيين التمهيديات كما هو مبين في بروتوكول النص.
تضخيم ثلاثة كيلو بيس خمسة رئيس وثلاثة الأسلحة الرئيسية homology من الحمض النووي الجينوم الكلاميدي المستخرج حديثا من قبل PCR في واحد أو اثنين من ردود الفعل تسفر عن جزء كاف لتجميع الحمض النووي في وقت لاحق. بعد تنقية وتركيز شظايا PCR كما هو موضح في بروتوكول النص، هضم 500 نانوغرام من pSUmC-4.0 متجه في رد فعل 20 ميكرولتر مع وحدة واحدة من الخلية وحدة واحدة من SBF واحد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. الجمع بين هضم وتنقية pSUmC-4.0 متجه وكلا رئيس الوزراء وخمسة homology الرئيسية ذراع منتجات PCR معا بنسبة 0.01 picomoles ناقلات إلى 0.09 picomoles من كل ذراع homology.
تجميع الشظايا في تفاعل تجميع الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحويل 50 ميكرولترات من E.coli القدرة على المنافسة الكهربائية مع ميكرولتر واحد من رد فعل الجمعية الحمض النووي. لوحة الإشريكية القولونية المحولة على لوحات LB agar التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ميليلتر سبتينوميسين.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، مستعمرات الشاشة للفلورس الأخضر والأحمر باستخدام مجهر مقلوب مقلوب. ومن المتوقع ما مجموعه 5 إلى 30 مستعمرة لكل لوحة أجار.
بعد حضانة الثقافة السائلة بين عشية وضحاها من المستعمرات المختارة، تأكيد إدراج كل ذراع homology في ناقلات باستخدام التمهيديات فحص PCR لتضخيم كل الإدراج. بذور الخلايا McCoy التي هي الليفية الماوس تستخدم عادة لزراعة الكلاميديا في اثنين من لوحات ستة جيدا كما هو موضح في بروتوكول النص. في أنبوب 1.5 ملليلتر، إضافة C.trachomatis البرية من نوع serovar L2 الهيئات الابتدائية، أو EBs، في وحدة التخزين التي هي كافية لتصيب 12 آبار من لوحة ستة جيدا في وزارة الداخلية من اثنين.
بيليه EBs في أكبر من 20، 000 مرات ز لمدة 30 دقيقة وتجاهل supernatant. بدء التحول الكلاميدي عن طريق إعادة الاعتماد بلطف على الـ EBs في 600 ميكرولترات من احتياطي كلوريد الكالسيوم. ثم، إضافة 12 ميكروغرام من pSUmC-4.0 بالإضافة إلى هوميولوجي الأسلحة إلى أنبوب وخلط بلطف الحل عن طريق النقر.
احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة الخفقان لخلط كل 10 دقيقة. إضافة حل التحول إلى 24 ملليلتر من HBSS ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف. نقل مليلترين من inoculum إلى كل بئر من الخلايا مكوي التقاء في لوحات ستة آبار.
تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 مرة ز لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية. إزالة inoculum واستبدالها بمليلترين في جيدا دورة ً عنانة نمو وسائل الإعلام رقم اثنين. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ما لا يقل عن سبع ساعات ولكن لا يزيد عن 12 ساعة، استبدال وسائل الإعلام مع ميليلتر اثنين في بئر من وسائل الإعلام اختيار رقم واحد. مواصلة حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة من وقت العدوى. حصاد والمرور على البكتيريا على أحادية جديدة من الخلايا مكوي باستخدام مكشطة الخلية لكشط بلطف monolayer مكوي لرفع الخلايا في وسائل الإعلام.
نقل المواد من كل بئر إلى أنبوب ملليلتر اثنين. بيليه مادة الخلية في أكبر من 20، 000 مرات ز في microcentrifuge لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المابير، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من HBSS عن طريق الأنابيب بلطف.
بيليه حطام الخلية في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. نقل فائقة إلى بئر جديدة من خلايا مكوي التقاء. إضافة ملليلتر إضافي من HBSS إلى كل بئر لحجم إجمالي قدره ملليلتر اثنين في البئر.
تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 مرة ز لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية. استبدل inoculum مع اختيار وسائل الإعلام رقم واحد بعد العدوى مباشرة. مواصلة تمرير البكتيريا على أحادية جديدة من الخلايا مكوي كل 48 ساعة حتى يتم الكشف عن إدراج الأحمر والخضراء باستخدام المجهر مقلوب epifluorescence 24 ساعة بعد العدوى.
بمجرد الكشف عن التضمينات الحمراء والخضراء، تابع تمرير الطبقة الأحادية كما قبل استخدام رقم اثنين من وسائط التحديد. استمر في تمرير الطبقة الأحادية حتى يتم الكشف عن التضمينات الخضراء فقط على مدار 24 ساعة بعد العدوى مما يشير إلى فقدان المتجه pSUmC-4.0 ودمج كاسيت اختيار اللوإكسب في الجينوم. حصاد وتجميد إدراج الأخضر فقط في SPG.
إثراء تضمينات الأخضر فقط إلى وزارة الداخلية بين 0.5 و 1.0 و حصاد monolayers في SPG كما هو موضح في النص. الحصول على اسكوت عن 50 ميكرولتر في 1.5 ملليلتر أنابيب وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية. بذور 384 جيدا لوحة ثقافة الأنسجة مع خلايا ماكوي كما هو موضح في بروتوكول النص.
تخفيف aliquot من البكتيريا الخضراء فقط في HBSS لتحقيق ما يقرب من 50 EBs لكل 20 ملليلتر. نقل inoculum المخفف إلى علبة الخزان. إزالة وسائل الإعلام من لوحة 384 جيدا من خلايا ماكوي التقاء عن طريق الخفقان بحزم لوحة كاملة رأسا على عقب في حاوية النفايات.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولترات من inoculum C.trachomatis إلى كل بئر. تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 مرة ز لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية. إزالة inoculum عن طريق الخفقان واستبدالها مع 50 ميكرولترز في بئر من وسائل الإعلام النمو رقم اثنين.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد احتضان اللوحة لمدة خمسة إلى 12 يومًا ، حدد الآبار الفردية مع تضمينات الفلورسنت الخضراء باستخدام مجهر مقلوب مقلوب أو منصة فحص عالية المحتوى. حصاد الآبار مع إدراج الأخضر فقط عن طريق كشط monolayer مع طرف P10.
نقل محتويات البئر بالكامل إلى أنبوب يحتوي على مليلترين من HBSS. مزيج بلطف وتطبيق مليلترين من inoculum إلى أحادية مكلورة موكو جديدة في لوحة ستة جيدا للعدوى. إثراء، تجميد، وتكيتر السكان التخفي.
تأكيد حذف الجينات المستهدفة من C.trachomatis المعزولة كلونلي باستخدام PCR الكمية. كرر عملية التحويل باستخدام clonally معزولة C.trachomatis FRAEM متحولة، PSU-Cre ناقلات، واختيار وسائل الإعلام رقم ثلاثة. يتم الكشف عن مرور الطبقة الأحادية حتى التضمينات الحمراء فقط مما يشير إلى فقدان كاسيت التحديد.
كلونالي عزل إدراج الأحمر فقط عن طريق الحد من التخفيف في لوحة 384 جيدا كما كان من قبل. إثراء السكان التخفي عن طريق passaging حتى وزارة الداخلية من 0.1. مرة واحدة المخصب، استبدال وسائل الإعلام اختيار مع نمو وسائل الإعلام رقم اثنين لبدء فقدان ناقلات PSU-Cre.
كلونالي عزل البكتيريا غير الفلورية كما كان من قبل. ومع ذلك، قم بمسح اللوحة يدويًا باستخدام مجهر برايتفيلد للكشف عن التضمينات. إثراء وتجميد البكتيريا.
شاشة سلالة متحولة باستخدام كمية في الوقت الحقيقي PCR، النشاف الغربية، وتسلسل الحمض النووي الجينوم كله كما هو موضح سابقا. تظهر البيانات التمثيلية التي يتم فيها استهداف tmeA لحذف الجينات. يتم إنشاء سلالة الحذف TmeaA C.trachomatis باستخدام FRAEM ويتم إنشاء سلالة C.trachomatis tmeA-lx باستخدام FLAEM.
تظهر أرقام نسخ الحمض النووي النسبية من tmeA و tmeB المصب ، gfp الواردة على كاسيت التحديد pSUmC-4.0 ، وال cre الواردة على متجه PSU-Cre. كلا سلالات متحولة تحتوي على حذف من tmeA locus. ومع ذلك، TmeA-lx لا يحتوي على شريط الاختيار كما هو مبين من عدم وجود الحمض النووي gfp.
وقد انخفض سلالة متحولة tmeA التعبير عن tmeB كما هو مبين في مستويات مرنا والبروتين. عندما يتم استخدام FLAEM لتوليد سلالة متحولة tmeA-lx، يتم استعادة هذا التعبير من tmeB كما اكتشفت من قبل مستويات مرنا والبروتين. البناء الدقيق للمتجه pSUmC مع الأسلحة homology ضروري للحذف المستهدف للجينات.
وينبغي أن تؤخذ من الوقت لضمان تجميع ناقلات دقيقة قبل التحول الكلاميدي. وقد وفرت FLAEM للباحثين أداة لدراسة جينات محددة وإجراء عمليات حذف مستهدفة دون الحاجة إلى انخفاض التعبير عن الجينات المستهدفة التي قد تربك الدراسات. يمكن استخدام المسوخ الحذف C.trachomatis التي تولدها FLAEM لدراسة مجموعة متنوعة من جوانب البيولوجيا الكلاميدية بما في ذلك الآليات التنموية والممرضة.
