A mutagênese de troca de fitas cassadas é um método importante porque a exclusão genética é uma ferramenta valiosa que pode ser utilizada para entender a função dos produtos genéticos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a exclusão genética direcionada sem infligir efeitos polares em genes a jusante. Identifique aproximadamente três regiões quilobase diretamente rio acima e rio abaixo do gene destinado à exclusão para servir como os cinco braços de ecologia primo e três principais para recombinação homólogo e atribua primers como indicado no protocolo de texto.
Amplifique os três quilobases cinco braços de epílogo primo e três principais de DNA genômico clamídial recém-extraído por PCR em uma ou duas reações para produzir fragmento suficiente para montagem posterior de DNA. Após purificar e concentrar os fragmentos de PCR conforme descrito no protocolo de texto, digerir 500 nanogramas de vetor pSUmC-4.0 em uma reação de 20 microliteres com uma unidade de célula um e uma unidade de SBF um de acordo com o protocolo do fabricante. Combine o vetor pSUmC-4.0 digerido e purificado e os cinco produtos PCR do braço de ecologia primo e três prime juntos a uma proporção de 0,01 picomoles vetor a 0,09 picomoles de cada braço de ecologia.
Monte os fragmentos em uma reação de montagem de DNA de acordo com o protocolo do fabricante. Transforme 50 microliters de eletrocompetente E.coli com um microliter da reação de montagem de DNA. Placa o E.coli transformado em placas de ágar LB contendo 100 microgramas por especttinomicina mililitro.
Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, colônias de tela para fluorescência verde e vermelha usando um microscópio invertido de epifluorescência. Um total de cinco a 30 colônias por placa de ágar é esperado.
Após uma incubação de cultura líquida durante a noite das colônias selecionadas, confirme a inserção de cada braço de ecologia no vetor usando os primers de triagem PCR para amplificar cada inserção. Células seed McCoy que são fibroblastos de rato tipicamente usados para cultivar clamídia em duas placas de seis poços, como descrito no protocolo de texto. Em um tubo de 1,5 mililitro, adicione c.trachomatis corpos elementares do tipo selvagem serovar L2, ou EBs, em um volume que é suficiente para infectar 12 poços de uma placa de seis poços em um MOI de dois.
Pellule os EBs em mais de 20.000 vezes g por 30 minutos e descarte o supernasce. Inicie a transformação clamídial reutilizando suavemente os EBs em 600 microliters de tampão de cloreto de cálcio. Em seguida, adicione 12 microgramas de pSUmC-4.0 mais braços de ecologia ao tubo e misture suavemente a solução com movimentos.
Incubar o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos para misturar a cada 10 minutos. Adicione a solução de transformação a 24 mililitros de HBSS e misture suavemente a pipetação. Transfira dois mililitros do inóculo para cada poço de células McCoy confluentes nas placas de seis poços.
Infecte por centrifugação a 900 vezes g por uma hora a 20 graus Celsius. Remova o inóculo e substitua por dois mililitros por bem RPMI de mídia de crescimento número dois. Incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Após um mínimo de sete horas, mas não mais do que 12 horas, substitua a mídia por dois mililitros por poço de mídia de seleção número um. Continue a incubação a 37 graus Celsius por 48 horas a partir do momento da infecção. Colher e passar as bactérias para uma monocamada fresca de células McCoy usando um raspador de células para raspar suavemente a monocamada McCoy para levantar as células na mídia.
Transfira o material de cada poço para um tubo de dois mililitros. Pelota o material celular a mais de 20.000 vezes g em um microcentrifuuge por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota celular em um mililitro de HBSS por tubos suavemente.
Pelota os detritos celulares a 200 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernante para um novo poço de células McCoy confluentes. Adicione um mililitro adicional de HBSS a cada poço para um volume total de dois mililitros por poço.
Infecte por centrifugação a 900 vezes g por uma hora a 20 graus Celsius. Substitua o inóculo por uma mídia de seleção número um imediatamente após a infecção. Continue repassando as bactérias para uma monocamada fresca de células McCoy a cada 48 horas até que inclusões vermelhas e verdes sejam detectadas usando um microscópio invertido de epifluorescência 24 horas após a infecção.
Uma vez detectadas inclusões vermelhas e verdes, continue a passar a monocamadas como antes de usar a mídia de seleção número dois. Continue a passar a monocamadas até que sejam detectadas inclusões somente verdes 24 horas após a infecção, o que indica a perda do vetor pSUmC-4.0 e a incorporação do de seleção loxP no genoma. Colher e congelar as inclusões somente verdes no SPG.
Enriqueça inclusões somente verdes a um MOI entre 0,5 e 1,0 e colhe as monocamadas em SPG, conforme descrito no texto. Obtenha alíquotas de 50 microliters em tubos de 1,5 mililitro e congele a menos 80 graus Celsius. Semente uma placa de cultura de tecido de 384 poços com células McCoy como descrito no protocolo de texto.
Diluir uma alíquota de bactérias somente verdes no HBSS para alcançar aproximadamente 50 EBs por 20 mililitros. Transfira o inóculo diluído para uma bandeja de reservatório. Remova a mídia da placa de 384 poços de células McCoy confluentes, apertando firmemente a placa de cabeça para baixo em um recipiente de lixo.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microliters de C.trachomatis inóculo a cada poço. Infecte por centrifugação a 900 vezes g por uma hora a 20 graus Celsius. Remova o inóculo flicking e substitua por 50 microliters por poço de mídia de crescimento número dois.
Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Depois de incubar a placa por cinco a 12 dias, identifique poços individuais com inclusões fluorescentes verdes usando um microscópio invertido de epifluorescência ou uma plataforma de triagem de alto conteúdo. Colher poços com inclusões somente verdes raspando a monocamadas com uma ponta P10.
Transfira todo o conteúdo do poço para um tubo contendo dois mililitros de HBSS. Misture suavemente e aplique os dois mililitros de inóculo em uma monocamada McCoy confluente fresca em uma placa de seis poços para infecção. Enriquecer, congelar e triunfar populações clonais.
Confirme a exclusão de genes-alvo de C.trachomatis clonalmente isolados usando PCR quantitativo. Repita o processo de transformação usando o mutante C.trachomatis FRAEM clonalmente isolado, vetor pSU-Cre e mídia de seleção número três. Passagem da monocamada até que sejam detectadas inclusões somente vermelhas que indicam perda do de seleção.
Isolar clonalmente as inclusões somente para vermelho limitando a diluição em uma placa de 384 poços como antes. Enriqueça populações clonais passando até um MOI de 0,1. Uma vez enriquecido, substitua a mídia de seleção por mídia de crescimento número dois para iniciar a perda do vetor pSU-Cre.
Isolar clonalmente bactérias não fluorescentes como antes. No entanto, escaneie manualmente a placa com um microscópio Brightfield para detectar inclusões. Enriqueça e congele as bactérias.
Tela para a cepa mutante usando PCR quantitativo em tempo real, manchas ocidentais e sequenciamento de DNA de genoma inteiro como descrito anteriormente. Dados representativos são mostrados nos quais o tmeA é alvo para exclusão genética. A cepa de exclusão C.trachomatis tmeaA é gerada usando FRAEM e a cepa C.trachomatis tmeA-lx é gerada usando FLAEM.
Números relativos de cópia de DNA de tmeA e tmeB a jusante, gfp contidos no de seleção pSUmC-4.0 e cre contidos no vetor pSU-Cre são todos mostrados. Ambas as cepas mutantes contêm uma exclusão do lócus tmeA. No entanto, o tmeA-lx não contém o de seleção, conforme indicado pela ausência de DNA gfp.
A cepa mutante tmeA diminuiu a expressão de tmeB, como mostrado pelos níveis de mRNA e proteína. Quando o FLAEM é usado para gerar a cepa mutante tmeA-lx, essa expressão de tmeB é restaurada conforme detectado pelos níveis de mRNA e proteína. A construção cuidadosa do vetor pSUmC com braços de emologia é essencial para a exclusão direcionada de genes.
Deve-se tomar tempo para garantir uma montagem vetorial precisa antes da transformação do clamídial. O FLAEM forneceu aos pesquisadores uma ferramenta para estudar genes específicos e fazer exclusões direcionadas sem ter diminuído a expressão de genes fora do alvo que podem confundir estudos. Os mutantes de exclusão de C.trachomatis gerados pelo FLAEM podem ser utilizados para estudar uma variedade de aspectos da biologia clamídia, incluindo mecanismos de desenvolvimento e patogênicos.
