קלטת floxed allelic חילופי mutagenesis היא שיטה חשובה כי מחיקת גנים הוא כלי רב ערך שניתן להשתמש בו כדי להבין את הפונקציה של מוצרי גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מחיקת גנים ממוקדת מבלי לגרום להשפעות קוטביות על גנים במורד הזרם. זהה כשלושה אזורי קילו-בארס ישירות במעלה הזרם ובמורד הזרם של הגן המיועד למחיקה כדי לשמש מחמש זרועות ההומולוגיה העיקריות ושלוש הזרועות ההומולוגיות העיקריות לקומבנציה הומולוגית ולהקצות פריימרים כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט.
הגבר את שלוש זרועות ההומולוגיה העיקריות ושלוש הזרועות ההומולוגיות העיקריות מדנ"א גנומי כלמידי שחולץ זה טרי על ידי PCR בתגובה אחת או שתיים כדי להניב שבר מספיק להרכבת דנ"א מאוחרת יותר. לאחר טיהור והתרכזות שברי PCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לעכל 500 ננוגרם של וקטור pSUmC-4.0 בתגובה 20 microliter עם יחידה אחת של תא אחד יחידה אחת של SBF אחד על פי פרוטוקול היצרן. שלב את וקטור pSUmC-4.0 המתעכל והמטוהר ואת חמשת מוצרי PCR של זרוע הומולוגיה עיקרית ושלושה ראשוניים יחד ביחס של 0.01 פיקומולס וקטור ל- 0.09 פיקומולס של כל זרוע חומולוגיה.
להרכיב את השברים בתגובת הרכבה DNA על פי פרוטוקול היצרן. רובוטריקים 50 microliters של E.coli אלקטרו-כשיר עם מיקרוליטר אחד של תגובת הרכבה DNA. צלחת E.coli טרנספורמציה על צלחות אגר LB המכיל 100 מיקרוגרם לכל spectinomycin מיליליטר.
דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, מושבות מסך עבור פלואורסצנטיות ירוקה ואדום באמצעות מיקרוסקופ הפוך epifluorescence. בסך הכל צפויות חמש עד 30 מושבות לכל צלחת אגר.
לאחר דגירה של תרבות נוזלית בן לילה של המושבות שנבחרו, לאשר את החדרת כל זרוע homology לתוך הווקטור באמצעות פריימרים הקרנת PCR כדי להגביר כל הכנסה. תאי זרע מקוי שהם פיברובלסטים של עכברים המשמשים בדרך כלל לטיפוח כלמידיה לשתי צלחות שש בארות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בצינור 1.5 מיליליטר, להוסיף C.trachomatis בר סוג סרובר L2 גופים יסודיים, או EBs, בנפח מספיק כדי להדביק 12 בארות של צלחת שש בארות ב MOI של שניים.
גלולה EBs מעל 20, 000 פעמים g במשך 30 דקות ולהשליך את העל טבעי. ליזום טרנספורמציה כלמידיאלית על ידי שימוש חוזר בעדינות EBs ב 600 microliters של חיץ סידן כלורי. לאחר מכן, להוסיף 12 מיקרוגרם של pSUmC-4.0 בתוספת זרועות הומולוגיה לצינור בעדינות לערבב את הפתרון על ידי הבהוב.
דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות מהבהב לערבב כל 10 דקות. מוסיפים את פתרון הטרנספורמציה ל-24 מיליליטר של HBSS ומערבבים על-ידי צינורות עדינים. מעבירים שני מיליליטר של האינוקולום לכל באר של תאי מקוי נוחים בצלחות שש בארות.
להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 פעמים g במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את inoculum ולהחליף עם שני מיליליטר לכל גם RPMI צמיחה מדיה מספר שתיים. הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר שבע שעות לפחות אך לא יותר מ-12 שעות, החלף את המדיה בשני מיליליטר ל-Well of selection media מספר אחת. ממשיכים את הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות מזמן ההדבקה. לקצור ולמעבר את החיידקים על מונוליאר טרי של תאי מקוי באמצעות מגרד תאים כדי לגרד בעדינות את מונוליאר מקוי כדי להרים את התאים לתוך התקשורת.
מעבירים את החומר מכל באר לצינור של שני מיליליטר. גלולה החומר התאי יותר מ 20, 000 פעמים גרם במיקרוצנטריפוגה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולת התא במיליליטר אחד של HBSS על ידי צינורות בעדינות.
גלולה פסולת התא ב 200 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את העל-טבעי לתוך באר טרייה של תאי מקוי נוחים. הוסף מיליליטר נוסף של HBSS לכל באר עבור נפח כולל של שני מיליליטר ל באר.
להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 פעמים g במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס. החלף את inoculum עם מדיה הבחירה מספר אחת מיד לאחר ההדבקה. המשיכו להעביר את החיידקים למונולייה טרייה של תאי מקוי כל 48 שעות עד שגילוי תכלילים אדומים וירוקים באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי 24 שעות לאחר ההדבקה.
לאחר זיהוי תכלילים אדומים וירוקים, המשך להעביר את המונולייה לפני השימוש במדיה מספר שתיים של הבחירה. המשך לעבור את monolayer עד הכללות ירוק בלבד מזוהים 24 שעות לאחר ההדבקה אשר מציין את אובדן וקטור pSUmC-4.0 ושילוב של קלטת הבחירה loxP לתוך הגנום. לקצור ולהקפיא את הכללות ירוק בלבד ב SPG.
להעשיר תכלילים ירוקים בלבד ל- MOI של בין 0.5 ל - 1.0 ולקצר את המונוטלים ל- SPG כמתואר בטקסט. להשיג aliquots של 50 microliters ב 1.5 צינורות מיליליטר ולהקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס. זרע צלחת תרבות רקמות 384 באר עם תאי מקוי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לדלל aliquot של חיידקים ירוקים בלבד ב- HBSS כדי להשיג כ 50 EBs לכל 20 מיליליטר. מעבירים את האנוקולום המדולל למגש מאגר. הסר את המדיה מצלחת 384 באר של תאים מקוי confluent על ידי בחוזקה מעיף את הצלחת כולה במהופך לתוך מיכל פסולת.
באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 50 microliters של C.trachomatis inoculum לכל באר. להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 פעמים g במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את inoculum על ידי הבהוב והחלפה עם 50 microliters ל באר של מדיה צמיחה מספר שתיים.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של הצלחת במשך חמישה עד 12 ימים, זהה בארות בודדות עם תכלילים פלואורסצנטיים ירוקים באמצעות מיקרוסקופ הפוך epifluorescence או פלטפורמת הקרנה תוכן גבוה. לקצור בארות עם תכלילים ירוקים בלבד על ידי גירוד monolayer עם קצה P10.
להעביר את כל התוכן של הבאר לתוך צינור המכיל שני מיליליטר של HBSS. מערבבים בעדינות ומחילים את שני המיליליטרים של אינוקולום על מונוליאר מקוי טרי בצלחת של שש באר לזיהום. להעשיר, להקפיא ולפטר אוכלוסיות שיבוט.
אשר את המחיקה של גנים ממוקדים מ C.trachomatis מבודדים clonally באמצעות PCR כמותי. חזור על תהליך הטרנספורמציה באמצעות מוטציית C.trachomatis FRAEM המבודדת, וקטור pSU-Cre ומדיית בחירה מספר שלוש. מעבר המונו-קוטל עד לזיהוי הכללות באדום בלבד המציין אובדן של קלטת הבחירה.
לבודד Clonally תכלילים אדום בלבד על ידי הגבלת דילול בצלחת 384 גם כמו קודם. להעשיר אוכלוסיות שיבוט על ידי מעבר עד MOI של 0.1. לאחר העשרה, החלף את המדיה הבחירה עם מדיה צמיחה מספר שתיים ליזום את האובדן של וקטור pSU-Cre.
לבודד Clonally חיידקים שאינם פלואורסצנטיים כמו קודם. עם זאת, סרוק ידנית את הלוחית באמצעות מיקרוסקופ של Brightfield כדי לזהות תכלילים. להעשיר ולהקפיא את החיידקים.
מסך עבור זן המוטנטים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת, כתמים מערביים, רצף DNA הגנום כולו כפי שתואר קודם לכן. נתונים מייצגים מוצגים שבהם tmeA מיועד למחיקת גנים. זן המחיקה C.trachomatis tmeaA נוצר באמצעות FRAEM ואת זן TmeA-lx C.trachomatis נוצר באמצעות FLAEM.
מספרי עותקי דנ"א יחסיים של tmeA ו- tmeB במורד הזרם, gfp הכלולים בקלטת הבחירה pSUmC-4.0, ו cre הכלולים בווקטור pSU-Cre מוצגים כולם. שני הזנים המוטנטים מכילים מחיקה של לוקוס tmeA. עם זאת, tmeA-lx אינו מכיל את קלטת הבחירה כפי שצוין על ידי היעדר DNA gfp.
זן המוטנטים tmeA ירד ביטוי של tmeB כפי שמוצג על ידי רמות mRNA וחלבון. כאשר FLAEM משמש ליצירת זן מוטנט tmeA-lx, ביטוי זה של tmeB משוחזר כפי שזוהה על ידי רמות mRNA וחלבון. בנייה זהירה של וקטור pSUmC עם זרועות הומולוגיה חיונית למחיקה ממוקדת של גנים.
יש לקחת זמן כדי להבטיח הרכבה וקטורית מדויקת לפני טרנספורמציה כלמידית. FLAEM סיפקה לחוקרים כלי לחקר גנים ספציפיים ולמחיקה ממוקדת מבלי לפגוע בביטוי של גנים מחוץ ליעד שעלולים לבלבל מחקרים. מוטציות למחיקת C.trachomatis שנוצרו על ידי FLAEM יכולות להיות מנוצלות כדי לחקור מגוון היבטים של ביולוגיה כלמידית כולל מנגנונים התפתחותיים ופתוגניים.
