Floxed kaset allelic değişim mutagenezi önemli bir yöntemdir çünkü gen delemesi gen ürünlerinin işlevini anlamak için kullanılabilen değerli bir araçtır. Bu tekniğin en büyük avantajı, aşağı akım genler üzerinde polar etkiler emilmeden hedeflenen gen deletion sağlar. Homolog rekombinasyon için beş asal ve üç prime homoloji kolu olarak hizmet vermek ve metin protokolünde belirtildiği gibi astar atamak için desilinme hedeflenen genin doğrudan yukarı ve aşağı doğru yaklaşık üç kilobase bölgesini belirleyin.
Üç kilobase beş asal ve üç prime homoloji kolları yeni çıkarılan konimydial genomik DNA PCR tarafından bir veya iki reaksiyonlar daha sonra DNA montajı için yeterli parça verim yükseltmek. PCR parçalarını metin protokolünde açıklandığı şekilde arındırdıktan ve yoğunlaştırdıktan sonra, üreticinin protokolüne göre bir birim hücre bir ve Bir Birim SBF ile 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 500 nanogram pSUmC-4.0 vektörü sindirin. Sindirilmiş ve saflaştırılmış pSUmC-4.0 vektörünü ve her beş asal ve üç ana homoloji kolu PCR ürününü 0,01 pikomols vektörü ile her homoloji kolunun 0,09 pikomoles oranında birleştirin.
Parçaları üreticinin protokolüne göre DNA montaj reaksiyonunda birleştirin. 50 mikrolitre elektro-beceriksiz E.coli'yi bir mikrolitre DNA montaj reaksiyonu ile dönüştürün. Mililitre spektinomisin başına 100 mikrogram içeren LB agar plakaları üzerine dönüştürülmüş E.coli plakası.
Plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, bir epifloresan ters mikroskop kullanarak yeşil ve kırmızı floresan için ekran kolonileri. Agar plakabaşına toplam 5-30 koloni bekleniyor.
Seçilen kolonilerin bir gecede sıvı kültür kuluçkasını takiben, her bir eklemeyi yükseltmek için PCR tarama astarlarını kullanarak her homoloji kolunun vektöre yerleştirilmesini onaylayın. Fare fibroblastları olan Tohum McCoy hücreleri genellikle metin protokolünde açıklandığı gibi iki altı kuyu plakaları halinde Klamidya yetiştirmek için kullanılır. Bir 1.5 mililitretüp, C.trachomatis vahşi tip serovar L2 temel organları ekleyin, veya EBs, iki moi bir altı kuyu plaka 12 kuyuları enfekte etmek için yeterli bir hacimde.
Pellet EBs fazla 20,000 kez g 30 dakika ve supernatant atın. 600 mikrolitre kalsiyum klorür tamponu yla EB'leri yavaşça yeniden suyararak klamydial dönüşümü başlatın. Daha sonra, tüp e 12 mikrogram pSUmC-4.0 artı homoloji kollar ekleyin ve yavaşça flicking tarafından çözelti karıştırın.
Her 10 dakikada bir karıştırmak için hareket ederek oda sıcaklığında 30 dakika tüp kuluçka. Dönüşüm çözeltisini 24 mililitre HBSS'ye ekleyin ve yavaşça pipetleme ile karıştırın. Altı kuyulu plakalarda bulunan uyumlu McCoy hücrelerinin her bir kuyuya iki mililitre inokül aktarın.
20 santigrat derecede bir saat için 900 kez g santrifüj ile enfekte. Inoculum çıkarın ve iyi RPMI büyüme medya sayısı iki mililitre ile değiştirin. Plakaları %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
En az yedi saat ama en fazla 12 saat sonra, bir numaralı seçim ortamının her biri için iki mililitre ile medya değiştirin. Kuluçkaya 37 derecede, enfeksiyon dan itibaren 48 saat boyunca devam edin. Hasat ve mcCoy hücrelerinin taze bir monolayer üzerine geçiş yavaşça medya içine hücreleri kaldırmak için McCoy monolayer kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanarak.
Her kuyudan iki mililitrelik bir tüp içine malzeme aktarın. Hücre materyalini 20.000 gr'dan büyük bir mikrosantrifüjde 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede peletleyin. Supernatant attıktan sonra, yavaşça borulama tarafından HBSS bir mililitre hücre pelet resuspend.
Hücre enkazını 200 kez g.00'da 5 dakika boyunca dört santigrat derecede peletleyin. Supernatant'ı yeni bir mccoy hücresi kuyuya aktarın. Her kuyuya iki mililitre lik toplam hacim için bir mililitre HBSS ekleyin.
20 santigrat derecede bir saat için 900 kez g santrifüj ile enfekte. Enfeksiyondan hemen sonra inoculumu bir numaralı seçilim ortamıyla değiştirin. Kırmızı ve yeşil inklüzimler enfeksiyon sonrası 24 saat ters mikroskop kullanılarak tespit edilene kadar her 48 saatte bir McCoy hücrelerinin yeni bir monotabakası üzerine bakteri geçirin.
Kırmızı ve yeşil eklemeler algılandıktan sonra, iki numaralı seçim ortamını kullanmadan önce olduğu gibi monokatmanı geçirmeye devam edin. PSUmC-4.0 vektörünün kaybedildiğini ve loxP seçim kasetinin genoma dahil edildiğini gösteren enfeksiyon sonrası 24 saat boyunca sadece yeşil içermeler tespit edilene kadar monolayer'ı geçirmeye devam edin. Hasat ve KMT yeşil sadece dahil dondurma.
0,5 ile 1,0 arasında bir MOI'ye sadece yeşil dahil etmeleri zenginleştirin ve metinde açıklandığı gibi monokatmanları KMT'ye dönüştürün. 1,5 mililitrelik tüplerde 50 mikrolitre lik bir işlem elde edin ve eksi 80 santigrat derecede donun. Metin protokolünde açıklandığı gibi McCoy hücreleri ile 384-iyi doku kültür plakatohum.
20 mililitre başına yaklaşık 50 EBs elde etmek için HBSS'de sadece yeşil bakterilerin bir aliquot seyreltin. Seyreltilmiş inoculumu bir rezervuar tepsisine aktarın. Tüm plakayı bir atık kabına ters çevirerek medyayı 384 kuyudaki uyumlu McCoy hücrelerinden çıkarın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyuya 50 mikrolitre C.trachomatis inoculum ekleyin. 20 santigrat derecede bir saat için 900 kez g santrifüj ile enfekte. İnokülü flicking'den çıkarın ve iki numaralı büyüme ortamının kuyubaşına 50 mikrolitre ile değiştirin.
Plakayı %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Plakayı beş ila 12 gün kuluçkaya yattıktan sonra, epifloresan ters mikroskop veya yüksek içerikli tarama platformu kullanarak yeşil floresan eklemelere sahip tek tek kuyuları belirleyin. Bir P10 ucu ile monolayer kazınarak yeşil sadece eklemeler ile hasat kuyuları.
Kuyunun tüm içeriğini iki mililitre HBSS içeren bir tüpe aktarın. Yavaşça karıştırın ve enfeksiyon için altı iyi plaka taze bir confluent McCoy monolayer inoculum iki mililitre uygulayın. Zenginleştirmek, dondurmak ve titer klonal popülasyonları.
Hedeflenen genlerin klonsal olarak izole edilmiş C.trachomatis'ten kantitatif PCR kullanarak silinmesini doğrulayın. Klonsal izole C.trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vektör ve seçim medya numarası üç kullanarak dönüşüm sürecini tekrarlayın. Seçim kasetinin kaybolduğunu gösteren tek katmanlı sadece kırmızı eklemeler algılanana kadar geçiş yapın.
Daha önce olduğu gibi 384 kuyuluk bir plakada seyreltme sınırlandırarak sadece kırmızı dahil leri klonlama. 0.1 MOI'a kadar geçerek klonal popülasyonları zenginleştirin. Zenginleştirdikten sonra, pSU-Cre vektörünün kaybını başlatmak için seçim ortamını iki numaralı büyüme ortamıyla değiştirin.
Klonsal olarak daha önce olduğu gibi floresan olmayan bakterileri izole edin. Ancak, eklemeleri algılamak için plakayı brightfield mikroskobuyla elle taz.rama. Bakterileri zenginleştirin ve dondurun.
Daha önce açıklandığı gibi kantitatif gerçek zamanlı PCR, Batı lekeleme ve tüm genom DNA dizilemesi kullanarak mutant suşu için ekran. Temsili veriler, gen delemesi için TMEA'nın hedeflendiği gösterilmiştir. C.trachomatis tmeaA silme suş FRAEM kullanılarak oluşturulur ve C.trachomatis tmeA-lx suşu FLAEM kullanılarak oluşturulur.
PSUmC-4.0 seçim kasetinde bulunan tmeA ve downstream tmeB, gfp ve pSU-Cre vektöründe bulunan kre'in göreli DNA kopya numaraları gösterilmiştir. Her iki mutant suşları tmeA locus bir silme içerir. Ancak, tmeA-lx gfp DNA yokluğunda belirtildiği gibi seçim kasetiçermez.
TMEA mutant suşu, mRNA ve protein düzeylerinin gösterdiği gibi tmeB ekspresyonunu azaltmıştır. FLAEM tmeA-lx mutant suşu oluşturmak için kullanıldığında, tmeB bu ifade mRNA ve protein düzeyleri tarafından tespit olarak geri yüklenir. PSUmC vektörünün homoloji kolları ile dikkatli bir şekilde yapılışı genlerin hedefli silinmesi için gereklidir.
Chlamydial dönüşümünden önce doğru vektör montajı sağlamak için zaman alınmalıdır. FLAEM araştırmacılara belirli genleri incelemek ve hedef dışı genlerin ekspresyonunu azaltmadan hedeflenmiş silmeler yapmak için bir araç sağlamıştır. FLAEM tarafından üretilen C.trachomatis silme mutantları, gelişimsel ve patojenik mekanizmalar da dahil olmak üzere klamydial biyolojinin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir.
