Floxed Kassette allelic Austausch Mutagenese ist eine wichtige Methode, weil Gen-Deletion ist ein wertvolles Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Funktion von Genprodukten zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine gezielte Genlöschung ermöglicht, ohne nachgeschaltete Gene polare Auswirkungen zu verursachen. Identifizieren Sie ungefähr drei Kilobase-Regionen direkt vor und nach dem Gene, das zum Löschen bestimmt ist, um als die fünf Prim- und drei Prime-Homologie-Arme für die homologe Rekombination zu dienen, und weisen Sie Primer zu, wie im Textprotokoll angegeben.
Verstärken Sie die drei Kilobase fünf Prim- und drei Prime-Homologie-Arme aus frisch extrahierter chlamydiergenomischer DNA durch PCR in ein oder zwei Reaktionen, um genügend Fragment für eine spätere DNA-Montage zu liefern. Nach der Reinigung und Konzentration der PCR-Fragmente, wie im Textprotokoll beschrieben, verdauen Sie 500 Nanogramm pSUmC-4.0-Vektor in einer 20-Mikroliter-Reaktion mit einer Einheit zelle eins und einer Einheit SBF eine nach dem Herstellerprotokoll. Kombinieren Sie den verdauten und gereinigten pSUmC-4.0-Vektor und sowohl die fünf Prime- als auch die drei Prime-Homologie-Arm-PCR-Produkte im Verhältnis 0,01 Picomoles Vektor zu 0,09 Picomolen jedes Homologiearms.
Montieren Sie die Fragmente in einer DNA-Montagereaktion gemäß dem Herstellerprotokoll. Transformieren Sie 50 Mikroliter elektrokompetenter E.coli mit einem Mikroliter der DNA-Montagereaktion. Die transformierten E.coli auf LB-Agarplatten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Spektinomycin.
Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag werden Kolonien für grüne und rote Fluoreszenz mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop untersucht. Insgesamt werden fünf bis 30 Kolonien pro Agarplatte erwartet.
Bestätigen Sie nach einer nächtlichen Inkubation der ausgewählten Kolonien die Einfügung jedes Homologiearms in den Vektor mithilfe der PCR-Screening-Primer, um jede Einfügung zu verstärken. Samen McCoy-Zellen, die Maus-Fibroblasten sind, die typischerweise für den Anbau von Chlamydien in zwei Sechs-Well-Platten verwendet werden, wie im Textprotokoll beschrieben. In einem 1,5-Milliliter-Rohr, fügen Sie C.trachomatis wild-Typ Serovar L2 Elementarkörper, oder EBs, bei einem Volumen, das ausreichend ist, um 12 Brunnen einer Sechs-Well-Platte bei einem MOI von zwei zu infizieren.
Pellet die EBs bei mehr als 20.000 mal g für 30 Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Initiieren Sie die Chlamydientransformation, indem Sie die EBs in 600 Mikroliter Calciumchloridpuffer sanft wieder aufsetzen. Dann fügen Sie 12 Mikrogramm pSUmC-4.0 plus Homologiearme in das Rohr und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Flicken.
Inkubieren Sie die Röhre bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um alle 10 Minuten zu mischen. Fügen Sie die Transformationslösung zu 24 Milliliter HBSS hinzu und mischen Sie sie durch sanftes Pipetieren. Übertragen Sie zwei Milliliter des Inokulums auf jeden Brunnen der konfluenten McCoy-Zellen in den Sechs-Brunnen-Platten.
Infizieren Sie durch Zentrifugation bei 900 mal g für eine Stunde bei 20 Grad Celsius. Entfernen Sie das Inokulum und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter pro Well RPMI Wachstumsmedium Nummer zwei. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Ersetzen Sie das Medium nach mindestens sieben Stunden, jedoch nicht mehr als 12 Stunden durch zwei Milliliter pro Brunnen der Auswahlmedien Nummer eins. Setzen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden ab dem Zeitpunkt der Infektion fort. Ernten und durchführen Sie die Bakterien auf eine frische Monoschicht von McCoy-Zellen, indem Sie einen Zellschaber verwenden, um die McCoy-Monoschicht sanft zu kratzen, um die Zellen in die Medien zu heben.
Übertragen Sie das Material von jedem Brunnen in ein Zwei-Milliliter-Rohr. Pellet das Zellmaterial bei mehr als 20.000 mal g in einer Mikrozentrifuge für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Zellpellet in einem Milliliter HBSS durch sanftes Pipetieren wieder aufsetzen.
Pellet die Zelle Schmutz bei 200 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in einen frischen Brunnen von konfluenten McCoy-Zellen. Fügen Sie einen zusätzlichen Milliliter HBSS zu jedem Brunnen für ein Gesamtvolumen von zwei Milliliter pro Brunnen hinzu.
Infizieren Sie durch Zentrifugation bei 900 mal g für eine Stunde bei 20 Grad Celsius. Ersetzen Sie das Inokulum durch Auswahlmedien Nummer eins unmittelbar nach der Infektion. Übergeben Sie die Bakterien alle 48 Stunden auf eine frische Monoschicht von McCoy-Zellen, bis rote und grüne Einschlüsse mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop 24 Stunden nach der Infektion nachgewiesen werden.
Sobald rote und grüne Einschlüsse erkannt wurden, fahren Sie mit dem Übergeben der Monolayer wie zuvor mit dem Auswahlmedium Nummer zwei fort. Fahren Sie mit der Monoschicht fort, bis 24 Stunden nach der Infektion nur grüne Einschlüsse erkannt werden, was auf den Verlust des pSUmC-4.0-Vektors und die Einbindung der LoxP-Auswahlkassette in das Genom hinweist. Ernten und einfrieren Sie die nur grünen Einschlüsse in der SPG.
Bereichern Sie nur grüne Einschlüsse zu einem MOI zwischen 0,5 und 1,0 und ernten Sie die Monolayer in SPG, wie im Text beschrieben. Erhalten Sie Aliquots von 50 Mikrolitern in 1,5 Milliliter-Röhren und gefrieren bei minus 80 Grad Celsius. Samen Sie eine 384-Well-Gewebekulturplatte mit McCoy-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Verdünnen Sie ein Aliquot von nur grünen Bakterien in HBSS, um etwa 50 EBs pro 20 Milliliter zu erreichen. Das verdünnte Inokulum in eine Reservoirwanne geben. Entfernen Sie die Medien von der 384-Well-Platte der konfluenten McCoy-Zellen, indem Sie die gesamte Platte auf den Kopf in einen Abfallbehälter schieben.
Mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter C.trachomatis inoculum zu jedem Brunnen hinzufügen. Infizieren Sie durch Zentrifugation bei 900 mal g für eine Stunde bei 20 Grad Celsius. Entfernen Sie das Inokulum durch Flicken und ersetzen Sie mit 50 Mikroliter pro Brunnen des Wachstumsmediums Nummer zwei.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach der Inkubation der Platte für fünf bis zwölf Tage, identifizieren Sie einzelne Brunnen mit grünen fluoreszierenden Einschlüssen mit einem epifluoreszenzinvertierten Mikroskop oder einer hochgehaltigen Screening-Plattform. Ernten Sie Brunnen mit nur grünen Einschlüssen, indem Sie die Monoschicht mit einer P10-Spitze kratzen.
Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Brunnens in ein Rohr mit zwei Millilitern HBSS. Mischen und tragen Sie die zwei Milliliter Inokulum vorsichtig auf eine frische, konfluente McCoy-Monoschicht in einer Sechs-Brunnen-Platte für Infektionen auf. Enrich, Freeze, und Titer klonale Populationen.
Bestätigen Sie die Deletion von gezielten Genen aus klonal isolierter C.trachomatis mit quantitativer PCR. Wiederholen Sie den Transformationsprozess mit dem klonal isolierten C.trachomatis FRAEM Mutant, pSU-Cre-Vektor und Selektionsmedien Nummer drei. Durchgehen sie die Monoschicht, bis nur rot gebundene Einschlüsse erkannt werden, was auf den Verlust der Selektionskassette hinweist.
Isolieren Sie die reinen Roteinschlüsse klonlich, indem Sie die Verdünnung in einer 384-Well-Platte wie bisher begrenzen. Bereichern Sie klonale Populationen durch Passaging bis zu einem MOI von 0,1. Ersetzen Sie nach der Anreicherung die Auswahlmedien durch Wachstumsmedien Nummer zwei, um den Verlust des pSU-Cre-Vektors zu initiieren.
Isolierung nicht fluoreszierender Bakterien wie bisher. Scannen Sie die Platte jedoch manuell mit einem Brightfield-Mikroskop, um Einschlüsse zu erkennen. Die Bakterien anreichern und einfrieren.
Bildschirm für den mutierten Stamm mit quantitativer Echtzeit-PCR, Western Blotting und ganzer Genom-DNA-Sequenzierung, wie zuvor beschrieben. Repräsentative Daten werden angezeigt, in denen tmeA für die Genlöschung bestimmt ist. Der C.trachomatis tmeaA Deletion Stamm wird mit FRAEM erzeugt und der C.trachomatis tmeA-lx Stamm wird mit FLAEM erzeugt.
Relative DNA-Kopiernummern von tmeA und downstream tmeB, gfp auf der pSUmC-4.0-Auswahlkassette und Kresse auf dem pSU-Cre-Vektor werden alle angezeigt. Beide mutierten Stämme enthalten eine Löschung des tmeA-Lokus. TmeA-lx enthält jedoch nicht die Selektionskassette, wie durch das Fehlen von gfp-DNA angegeben.
Der tmeA-mutierte Stamm hat die Expression von tmeB verringert, wie mRNA und Proteinspiegel zeigen. Wenn FLAEM verwendet wird, um den tmeA-lx mutierten Stamm zu erzeugen, wird diese Expression von tmeB wiederhergestellt, wie sie durch mRNA und Proteinspiegel nachgewiesen wird. Eine sorgfältige Konstruktion des pSUmC-Vektors mit Homologiearmen ist für die gezielte Löschung von Genen unerlässlich.
Es sollte Zeit in Anspruch genommen werden, um eine genaue Vektormontage vor der Chlamydientransformation sicherzustellen. FLAEM hat Forschern ein Werkzeug zur Verfügung gestellt, um bestimmte Gene zu untersuchen und gezielte Löschungen vorzunehmen, ohne die Expression von Ab-Ziel-Genen verringert zu haben, was Studien verwirren könnte. C.trachomatis Deletion Mutanten, die von FLAEM erzeugt werden, können verwendet werden, um eine Vielzahl von Aspekten der Chlamydienbiologie zu studieren, einschließlich Entwicklungs- und pathogener Mechanismen.
