Floxed cassette allelic exchange mutagenesis est une méthode importante parce que la suppression des gènes est un outil précieux qui peut être utilisé pour comprendre la fonction des produits génétiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une suppression ciblée des gènes sans infliger d’effets polaires sur les gènes en aval. Identifier environ trois régions kilobase directement en amont et en aval du gène visé par la suppression pour servir de cinq bras homologiques principaux et trois premiers pour la recombinaison homologue et assigner des amorces comme indiqué dans le protocole de texte.
Amplifiez les trois bras premiers et trois bras d’homologie principaux de l’ADN génomique chlamydial fraîchement extrait par PCR dans une ou deux réactions pour produire assez de fragment pour l’assemblage ultérieur d’ADN. Après avoir purifié et concentré les fragments de PCR tels que décrits dans le protocole de texte, digérer 500 nanogrammes de vecteur pSUmC-4.0 dans une réaction de 20 microlitres avec une unité de cellule un et une unité de SBF un selon le protocole du fabricant. Combinez le vecteur pSUmC-4.0 digéré et purifié et les cinq premiers et trois principaux produits PCR de bras d’homologie ensemble à un rapport de 0,01 vecteur picomoles à 0,09 picomoles de chaque bras d’homologie.
Assembler les fragments dans une réaction d’assemblage d’ADN selon le protocole du fabricant. Transformez 50 microlitres d’E.coli électrocompétent avec un microlitre de la réaction d’assemblage d’ADN. Plaquez l’E.coli transformé sur des plaques d’agar LB contenant 100 microgrammes par spectinomycine millilitre.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, filtrer les colonies de fluorescence verte et rouge à l’aide d’un microscope inversé à épifluorescence. Un total de cinq à 30 colonies par plaque d’agar est prévu.
Après une incubation de culture liquide du jour au lendemain des colonies sélectionnées, confirmer l’insertion de chaque bras homologique dans le vecteur à l’aide des amorces de criblage PCR pour amplifier chaque insertion. Graines McCoy cellules qui sont des fibroblastes de souris généralement utilisés pour cultiver la chlamydia en deux plaques de six puits comme décrit dans le protocole de texte. Dans un tube de 1,5 millilitre, ajouter des corps élémentaires C.trachomatis de type sauvage L2, ou EBs, à un volume suffisant pour infecter 12 puits d’une plaque de six puits à un MOI de deux.
Pelleter les ER à plus de 20 000 fois g pendant 30 minutes et jeter le surnatant. Initier la transformation chlamydiale en réutilisant doucement les ER dans 600 microlitres de tampon de chlorure de calcium. Ensuite, ajoutez 12 microgrammes de pSUmC-4.0 plus les bras d’homologie au tube et mélangez doucement la solution en feuilletant.
Incuber le tube à température ambiante pendant 30 minutes en feuilletant pour mélanger toutes les 10 minutes. Ajouter la solution de transformation à 24 millilitres de HBSS et mélanger en pipetting doucement. Transférer deux millilitres de l’inoculum à chaque puits de cellules McCoy confluentes dans les plaques de six puits.
Infecter par centrifugation à 900 fois g pendant une heure à 20 degrés Celsius. Retirez l’inoculum et remplacez-le par deux millilitres par puits RPMI média de croissance numéro deux. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Après un minimum de sept heures, mais pas plus de 12 heures, remplacer les médias par deux millilitres par puits de sélection numéro un des médias. Poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius pendant 48 heures à partir du moment de l’infection. Récoltez et traversez les bactéries sur un monocouche frais de cellules McCoy à l’aide d’un grattoir cellulaire pour gratter doucement le monocouche McCoy pour soulever les cellules dans les médias.
Transférer le matériau de chaque puits dans un tube de deux millilitres. Pelleter le matériel cellulaire à plus de 20 000 fois g dans une microcentrifugeuse pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de HBSS en pipetting doucement.
Pelleter les débris cellulaires à 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un puits frais de cellules McCoy confluentes. Ajouter un millilitre supplémentaire de HBSS à chaque puits pour un volume total de deux millilitres par puits.
Infecter par centrifugation à 900 fois g pendant une heure à 20 degrés Celsius. Remplacez l’inoculum par le média de sélection numéro un immédiatement après l’infection. Continuer à transmettre la bactérie sur un monocouche frais de cellules McCoy toutes les 48 heures jusqu’à ce que les inclusions rouges et vertes soient détectées à l’aide d’un microscope inversé d’épifluorescence 24 heures après l’infection.
Une fois que les inclusions rouges et vertes sont détectées, continuer à passer le monocouche comme avant d’utiliser le média de sélection numéro deux. Continuer à passer le monocouche jusqu’à ce que les inclusions vertes seulement soient détectées 24 heures après l’infection, ce qui indique la perte du vecteur pSUmC-4.0 et l’incorporation de la cassette de sélection du loxP dans le génome. Récoltez et congelez les inclusions vertes seulement dans SPG.
Enrichissez les inclusions vertes seulement à un MOI compris entre 0,5 et 1,0 et récoltez les monomères dans SPG tel que décrit dans le texte. Obtenez des aliquots de 50 microlitres dans des tubes de 1,5 millilitre et congelez à moins 80 degrés Celsius. Ensemencer une plaque de culture tissulaire de 384 puits avec des cellules McCoy tel que décrit dans le protocole de texte.
Diluer un aliquot de bactéries vertes seulement dans HBSS pour atteindre environ 50 EBs par 20 millilitres. Transférer l’inoculum dilué dans un plateau-réservoir. Retirez les supports de la plaque de 384 puits de cellules McCoy confluentes en faisant glisser fermement toute la plaque à l’envers dans un conteneur à déchets.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 50 microlitres d’inoculum C.trachomatis à chaque puits. Infecter par centrifugation à 900 fois g pendant une heure à 20 degrés Celsius. Retirez l’inoculum en feuilletant et remplacez-le par 50 microlitres par puits de croissance numéro deux.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après avoir incubé la plaque pendant cinq à 12 jours, identifiez les puits individuels avec des inclusions fluorescentes vertes à l’aide d’un microscope inversé d’épifluorescence ou d’une plate-forme de dépistage à haute teneur. Récoltez les puits avec des inclusions vertes seulement en raclant le monocouche avec une pointe P10.
Transférer tout le contenu du puits dans un tube contenant deux millilitres de HBSS. Mélanger délicatement et appliquer les deux millilitres d’inoculum sur un monocouche McCoy confluent frais dans une assiette de six puits pour l’infection. Enrichir, congeler et titer les populations clonales.
Confirmer la suppression des gènes ciblés à partir de C.trachomatis isolés clonally à l’aide de PCR quantitative. Répétez le processus de transformation à l’aide du mutant C.trachomatis FRAEM isolé, du vecteur pSU-Cre et du média de sélection numéro trois. Passer le monocouche jusqu’à ce que des inclusions uniquement rouges soient détectées, ce qui indique la perte de la cassette de sélection.
Isoler clonally inclusions rouge seulement en limitant la dilution dans une plaque de 384 puits comme avant. Enrichir les populations clonales en réussissant jusqu’à un MOI de 0,1. Une fois enrichi, remplacez le média de sélection par le média de croissance numéro deux pour initier la perte du vecteur pSU-Cre.
Isoler clonally bactéries non fluorescentes comme avant. Toutefois, numérisez manuellement la plaque à l’aide d’un microscope Brightfield pour détecter les inclusions. Enrichir et congeler les bactéries.
Dépistage de la souche mutante à l’aide d’un PCR quantitatif en temps réel, d’un ballonnement occidental et d’un séquençage de l’ADN du génome entier tel qu’il a été décrit précédemment. Des données représentatives sont affichées dans lesquelles tmeA est ciblé pour la suppression des gènes. La souche de suppression C.trachomatis tmeaA est générée à l’aide de FRAEM et la souche C.trachomatis tmeA-lx est générée à l’aide de FLAEM.
Les numéros relatifs de copie d’ADN de tmeA et de tmeB en aval, de gfp contenus sur la cassette de sélection pSUmC-4.0, et de cre contenus sur le vecteur pSU-Cre sont tous montrés. Les deux souches mutantes contiennent une suppression du locus tmeA. Cependant, tmeA-lx ne contient pas la cassette de sélection comme indiqué par l’absence d’ADN gfp.
La souche mutante tmeA a diminué l’expression du tmeB comme le montrent les niveaux d’ARNm et de protéines. Lorsque flaem est utilisé pour générer la souche mutante tmeA-lx, cette expression de tmeB est restaurée comme détecté par l’ARNm et les niveaux de protéines. La construction soigneux du vecteur de pSUmC avec des bras d’homologie est essentielle pour la suppression ciblée des gènes.
Il faut prendre le temps d’assurer un assemblage vectoriel précis avant la transformation chlamydiale. Flaem a fourni aux chercheurs un outil pour étudier des gènes spécifiques et faire des suppressions ciblées sans avoir diminué l’expression de gènes hors cible qui peuvent confondre les études. Les mutants de suppression de C.trachomatis générés par FLAEM peuvent être utilisés pour étudier une variété d’aspects de la biologie chlamydiale, y compris les mécanismes développementaux et pathogènes.
