Floxed кассета allelic mutagenesis обмена является важным методом, потому что удаление генов является ценным инструментом, который может быть использован для понимания функции генных продуктов. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет целенаправленное удаление генов без нанесения полярного воздействия на гены вниз по течению. Определите приблизительно три региона килобазы непосредственно вверх и вниз по течению от гена, предназначенного для удаления, чтобы служить в качестве пяти основных и трех основных гомологических рук для гомологичной рекомбинации и назначить праймеры, как указано в текстовом протоколе.
Увеличь три килобазы пять премьер и три премьер гомологии оружия из свежевыжатой хламидиальной геномной ДНК ПЦР в одной или двух реакций, чтобы дать достаточно фрагмента для более поздней сборки ДНК. После очистки и концентрации фрагментов ПЦР, описанных в текстовом протоколе, дайджест 500 нанограммов вектора pSUmC-4.0 в 20 микролитровой реакции с одной единицей ячейки 1 и одной единицей SBF один в соответствии с протоколом производителя. Комбинат переваренных и очищенных pSUmC-4.0 вектор и как пять премьер и три премьер гомологии руку PCR продуктов вместе в соотношении 0,01 пикомол вектор 0,09 пикомолы каждой гомологии руку.
Соберите фрагменты в реакции сборки ДНК в соответствии с протоколом производителя. Преобразуй 50 микролитров электрокомпетента E.coli одним микролитером реакции сборки ДНК. Плита преобразован E.coli на пластины LB агар, содержащие 100 микрограмм на миллилитр спектромицин.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день, экран колоний для зеленого и красного флуоресценции с помощью эпифлуоресценции перевернутый микроскоп. В общей сложности от пяти до 30 колоний на агар пластины, как ожидается.
После ночной инкубации жидкой культуры выбранных колоний, подтвердите вставку каждой гомологической руки в вектор с помощью праймеров скрининга ПЦР для усиления каждой вставки. Семена Маккой клетки, которые мыши фибробласты обычно используются для выращивания хламидиоза в две шесть хорошо пластин, как описано в текстовом протоколе. В 1,5 миллилитровую трубку, добавить C.trachomatis дикого типа серовар L2 элементарных органов, или EBs, на том, который достаточно, чтобы заразить 12 скважин из шести скважин пластины в МВД из двух.
Пеллет EBs на более чем 20000 раз г в течение 30 минут и отказаться от супернатанта. Инициатор хламидиальной трансформации, мягко resuspending EBs в 600 микролитров хлорида кальция буфера. Затем добавьте в трубку 12 микрограммов pSUmC-4.0 плюс гомологические руки и аккуратно смешайте раствор, щелкнув.
Инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 30 минут стряхивая смешивать каждые 10 минут. Добавьте раствор преобразования в 24 миллилитров HBSS и перемешайте с помощью мягкой трубы. Передача двух миллилитров инокулума в каждую колодец стеченных клеток Маккой в шести-хорошо пластин.
Заразить центрифугой при 900 раз г в течение одного часа при 20 градусах по Цельсию. Удалите inoculum и заменить двумя миллилитров на хорошо RPMI роста СМИ номер два. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
После минимум семи часов, но не более 12 часов, заменить средства массовой информации с двумя миллилитров на колодец выбора средств массовой информации номер один. Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов с времени заражения. Урожай и прохождение бактерий на свежий монослой mcCoy клеток с помощью сотового скребка, чтобы мягко царапать Маккой монослой, чтобы поднять клетки в средствах массовой информации.
Перенесите материал из каждого хорошо в двухмилитровую трубку. Пеллет клеточного материала при более чем 20 000 раз г в микроцентрифуге в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После отбрасывания супернатанта, повторное высасывания гранулы клетки в один миллилитр HBSS, мягко pipetting.
Пеллет клеточного мусора в 200 раз g в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите супернатант в свежий колодец стеченных клеток Маккой. Добавьте еще один миллилитр HBSS к каждой хорошо для общего объема двух миллилитров на колодец.
Заразить центрифугой при 900 раз г в течение одного часа при 20 градусах по Цельсию. Замените inoculum с средством выбора номер один сразу после инфекции. Продолжайте передавать бактерии на свежий монослой клеток Маккой каждые 48 часов, пока красные и зеленые включения не будут обнаружены с помощью эпифлуоресценции перевернутый микроскоп 24 часов после заражения.
После обнаружения красных и зеленых включений продолжайте передавать монослой, как и прежде, используя средства выбора номер два. Продолжайте проходить монослой до тех пор, пока не будут обнаружены включения только зеленого цвета в течение 24 часов после заражения, что указывает на потерю вектора pSUmC-4.0 и включение кассеты выбора loxP в геном. Урожай и заморозить только зеленые включения в SPG.
Обогащают включения только зеленого цвета в МВД в размере от 0,5 до 1,0 и собирают монослои в СПГ, как описано в тексте. Получить aliquots 50 микролитров в 1,5 миллилитров труб и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Семя 384-хорошо ткани культуры пластины с клетками Маккой, как описано в текстовом протоколе.
Разбавить aliquot зеленых только бактерии в HBSS для достижения примерно 50 EBs на 20 миллилитров. Перенесите разбавленный инокулум в лоток резервуара. Удалите средства массовой информации из 384-ну пластины стеченных клеток Маккой, твердо стряхивая всю пластину вверх дном в контейнер для отходов.
Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 микролитров C.trachomatis inoculum к каждой колодец. Заразить центрифугой при 900 раз г в течение одного часа при 20 градусах по Цельсию. Удалите inoculum, стряхивая и заменить 50 микролитров на колодец роста средств массовой информации номер два.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. После инкубации пластины в течение пяти-12 дней, определить отдельные скважины с зелеными флуоресцентными включениями с помощью эпифлуоресценции перевернутый микроскоп или высокое содержание скрининговой платформы. Урожай скважины с зелеными только включения, соскоб монослой с P10 отзыв.
Перенесите все содержимое колодец в трубку, содержащую два миллилитров HBSS. Аккуратно перемешайте и нанесите два миллилитров инокулума на свежий стеченный монослой Маккой в шести-хорошо пластины для инфекции. Обогатить, заморозить, и titer клональных популяций.
Подтвердите удаление целевых генов из клонально изолированных C.trachomatis с помощью количественного ПЦР. Повторите процесс преобразования с помощью клонально изолированного мутанта C.trachomatis FRAEM, вектора pSU-Cre и средства выбора номер три. Прохождение монослой до тех пор, пока красные включения не будут обнаружены, что указывает на потерю кассеты выбора.
Клонально изолировать красные только включения, ограничивая разбавления в 384-хорошо пластины, как и раньше. Обогатить клональные популяции путем прохода до МВД 0,1. После обогащения, заменить выбор средств массовой информации с ростом средств массовой информации номер два, чтобы инициировать потерю вектора PSU-Cre.
Клонально изолировать нефлуоресцентные бактерии, как и раньше. Тем не менее, вручную сканировать пластину с помощью микроскопа Brightfield для обнаружения включений. Обогатить и заморозить бактерии.
Экран для штамма мутантов с использованием количественных ПЦР в реальном времени, западного blotting, и весь геном секвенирования ДНК, как описано ранее. Показаны репрезентативные данные, в которых tmeA предназначен для удаления генов. Штамм удаления C.trachomatis tmeaA генерируется с помощью FRAEM, а штамм C.trachomatis tmeA-lx генерируется с помощью FLAEM.
Относительные номера копирования ДНК tmeA и вниз по течению tmeB, gfp, содержащиеся на кассете выбора pSUmC-4.0, и cre, содержащиеся на векторе pSU-Cre, все показаны. Оба штамма мутантов содержат удаление локуса tmeA. Тем не менее, tmeA-lx не содержит кассету выбора, о чем свидетельствует отсутствие ДНК gfp.
Штамм мутантов tmeA снизил экспрессию tmeB, как показано на уровнях мРНК и белка. Когда FLAEM используется для генерации штамма мутантов tmeA-lx, это выражение tmeB восстанавливается, как обнаружено по уровням мРНК и белка. Тщательная конструкция вектора pSUmC с гомологией оружия имеет важное значение для целевого удаления генов.
Необходимо взять время, чтобы обеспечить точную сборку вектора до хламидиальной трансформации. FLAEM предоставил исследователям инструмент для изучения конкретных генов и сделать целевые удаления без снижения экспрессии от целевых генов, которые могут запутать исследования. C.trachomatis удаления мутантов порожденных FLAEM могут быть использованы для изучения различных аспектов хламидиальной биологии, включая развитие и патогенных механизмов.
