بروتوكولنا يسمح لنا لتتبع التوزيع الحيوي وتأكيد استيعاب الأنسجة الخاصة من الببتيد من الفائدة باستخدام منهجيتين منفصلة ولكن متكاملة. يمكننا استخدام هذا البروتوكول لتحقيق أقصى قدر من البيانات التي تم الحصول عليها من واحد والحصول على بيانات التصوير الفلورية المحورية الكمية. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا الحصول على صور المجهر النوعية.
بعد الحصول على مرحلة صلبة توليفها C-اديبينوس غطاء قبعة مع N-رفينوس المسمى مع Cy5.5 من منشأة توليف الببتيد، وجعل واحد أو 10 ميل اليرمل المحلول من ctp في ثنائي الفينيل السلفيد لتخزين في ناقص 80 درجة مئوية محمية من الضوء. في يوم التجربة، قم بتحميل جرعة 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من Cy5.5 CTP في 200 ميكرولترات من PBS في حقنة الأنسولين. تزن الماوس وتسليم عن طريق الوريد الببتيد في تخدير ستة أسابيع أنثى الماوس CD1.
السماح للببتيد لتعميم لفترة زمنية تجريبية محددة مسبقا قبل القتل الرحيم الماوس باستخدام غرفة CO2 عالية التدفق واستخدام مقص لفتح تجويف الصدر وجعل صغيرة في الجدار الحر الجانبي من الأذين الأيمن. استخدام حقنة خمسة ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 26 لضخ ثلاثة ملليلتر من 10٪ buffered الفوسفات من خلال قمة البطين الأيسر لإصلاح الأنسجة وطرد أي خلايا الدم الحمراء. ثم جمع القلب والرئة والكبد والكلى والطحال والأمعاء الكبيرة والصغرى والمثانة والمبايض أو الخصيتين والدماغ في آبار فردية من لوحة 12-well للتصوير البصري السابقين vivo.
للتصوير في الجسم الحي للصور التي تم تحويلها CTP، بدء برنامج الحصول على الصور وانقر فوق تهيئة لإعداد النظام للتصوير. افتح معالج التصوير وحدد فلوريسنس وزوج تصفية. انقر فوق أسماء، الأصباغ، السيانيد، و Cy5 لتعيين المعلمات الإثارة والانبعاثات.
وانقر على "الإعدادات اليدوية" لتعيين التعرض لثانية واحدة، وbinning إلى الصغيرة، وF / إيقاف إلى ثمانية، ومجال الرؤية إلى 15 سنتيمترا. انقر فوق الحصول على وتعيين المجلد الذي تريد حفظ العينات فيه. إضافة المعلومات التجريبية المناسبة في إطار تحرير تسميات الصور ثم انقر فوق موافق. ستظهر الصورة المكتسبة.
تعيين وحدات لكفاءة مشع. انقر نقراً مزدوجاً فوق الصورة وانقر فوق التصحيحات والطرح الفلوري التكيفي الخلفية. ضبط عتبة لتغطية فقط الأجهزة ذات الفائدة مع الأرجواني.
بدلاً من ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد "منطقة اقتصاص" لرسم مربع يحتوي على كافة العينات ذات الأهمية. عندما تم الحصول على جميع الصور، نقل العينات إلى قوارير متألقة تحتوي على 10٪ من الفوسفات الفورين المخزنة في حجم لا يقل عن 20 مرة من الأنسجة وتخزين الأنسجة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لمدة 48 ساعة على الأقل. لتحديد حجم الصور، تعيين وحدات للكفاءة مشع والمنطقة ذات الأهمية إلى أربعة في ثلاثة.
اضبط مربع منطقة الاهتمام لتغطية جميع الآبار بشكل متكافئ وانقر على قياس مناطق الاهتمام. ثم انقر فوق منطقة الشبكة لقياسات الفائدة لمطابقة خلايا المنطقة التي تهمك وانقر فوق تصدير لحفظ البيانات في ملف نصي أو CSV. عندما تكون الأجهزة ثابتة بما فيه الكفاية بعد 48 ساعة على الأقل، نقل العينات إلى تجهيز الأنسجة وتضمين الكاسيتات وتحميل الكاسيتات في آلة معالجة الأنسجة.
تعيين المعالج لتجفيف الأنسجة مع الإيثانول كما هو مبين، تليها إزالة مع اثنين من العلاجات الزيلين 30 دقيقة وضخ البارافين مع أربعة علاجات البارافين 30 دقيقة. بعد العلاج البارافين الماضي، وإزالة الأنسجة من آلة المعالجة. ضع الأنسجة في قوالب معدنية فردية وخط كل قالب مع البارافين المنصهر.
ضع القوالب على طبق بارد. كما البارافين في الجزء السفلي من القالب يبدأ في ترسيخ، ووضع الأجهزة في البارافين. عندما تم وضع جميع الأجهزة، ضع كاسيت المسمى على رأس القالب كدعم وملء القوالب بالبارافين المنصهر.
السماح للparffin لتبرد حتى الصلبة قبل تخزين كتل في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، اقامة microtome مع زاوية شفرة من ست درجات وسمك قسم من 10 ميكرومتر وجبل كتل الأنسجة في microtome. تبدأ القطع حتى يتم الحصول على أقسام تحتوي على الأنسجة ووضع كتل الوجه إلى أسفل في 38 درجة مئوية درجة الماء المقطر حمام لمدة خمس دقائق أو حتى الأنسجة قد استوعبت بعض الرطوبة.
عندما يظهر مخطط أبيض رفيع للأنسجة في الكتلة ، ضع الأنسجة على كتلة ثلج مسطحة لمدة 10 دقائق قبل إعادته إلى الميكراتوم في نفس الاتجاه كما تم تحميله للتو. ابدأ في الحصول على الشرائح التي تسمح للمقاطع المقتطعة بأن تشكل أشرطة طويلة من ستة إلى عشرة أقسام لكل منها. لضمان الحصول على قسم الأنسجة بنجاح، حافظ على رطوبة الكتلة.
العودة كتلة إلى الجليد إذا كانت نوعية القسم رديئة أو تبدأ في الانخفاض. تجاهل شرائط البارافين دون المستوى الأمثل حتى يتم إنتاج شريط عالي الجودة من الطول الكافي لتغطية شريحة. استخدام حافة حادة لنقل شرائط الجودة في حمام الماء 38 درجة مئوية والسماح للأبواب الجلوس على سطح الماء المقطر حتى أنها مجرد سلاسة.
تعويم الأجزاء المسطحة على سطح شريحة زجاجية نظيفة وصهر الشمع في فرن درجة مئوية 65 لمدة 30 دقيقة. لفك الـ 10 دقائق لكل علاج، عالج العينات ثلاث مرات بالزيلين. بعد العلاج الزيلين الماضي، اُعادي الأنسجة بغمر الإيثانول التنازلي لمدة خمس دقائق كما هو مبين، يليه غمر لمدة خمس دقائق في محلول ملحي ثلاثي المخزن.
بعد السماح للشرائح لتجف بين عشية وضحاها، جبل المقاطع مع الأغطية و 125 ميكرولترات من تركيب المتوسطة تكمل مع DAPI وتجفيف الشرائح بين عشية وضحاها محمية من الضوء قبل التصوير عن طريق المجهر الفلوريس. بعد التثبيت، يتم ترتيب القلب والرئتين والكبد والكلى والطحال والدماغ من الحيوانات التجريبية والتحكم في لوحة 12-well للتصوير الفلوري البصري السابق vivo. عند تحويل العد إلى كفاءة مشعة، يمكن تحديد بيانات الفلوريسنس كميا لكل مجموعة من الأجهزة.
من المهم ملاحظة أن الأجهزة المختلفة تظهر الفلورس التلقائي استجابة لأطوال موجية مختلفة. ترتبط الأطوال الموجية الإثارة أقصر مثل البروتين الفلوري الأخضر المعزز مع مستويات أعلى من الفلورسيه السيارات وخاصة في الكبد والدماغ من أقصى الأحمر أو القريب الأشعة تحت الحمراء موجات. رسميين التثبيت والبارافين تضمين أقسام الأنسجة من كل جهاز يسمح للتحليل المناعية للفلوروكيميائية من علامات الخلية من الفائدة، فضلا عن الكم من الخلايا المناعية أو stromal من الفائدة داخل كل نسيج.
اضبط إعدادات التصوير لتجنب التشبع وتتبع الإعدادات، ثم قم بتطبيق إعدادات الاكتساب نفسها على عينات أخرى في نفس التجربة للتناسق والدقة. يمكن أيضًا إجراء الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة إذا كان الببتيد المرشح الذي يخترق الخلية يشارك في ترجمة بنية أو بروتين من الاهتمام.
