Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Bioverteilung zu verfolgen und die gewebespezifische Internalisierung eines von Interesse sindden Peptids mit zwei separaten, aber komplementären Methoden zu bestätigen. Wir können dieses Protokoll verwenden, um die von einem einzelnen Tier erhaltenen Daten zu maximieren und quantitative axiale Fluoreszenz-Bildgebungsdaten zu erfassen. Zusätzlich können wir qualitative Mikroskopbilder erhalten.
Nach dem Erwerb fester Phase synthetisierte C-terminus Amid Kappe CTPs mit einem N-Terminus mit Cy5.5 aus einer Peptid-Synthese-Anlage beschriftet, machen eine ein oder 10 Millimolar-Lagerlösung aliquot von CTP in Dimethylsulfoxid für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius vor Licht geschützt. Am Tag des Experiments eine Dosis von 10 Milligramm pro Kilogramm Cy5,5 CTP in 200 Mikroliter PBS in eine Insulinspritze laden. Wiegen Sie eine Maus und geben Sie das Peptid intravenös in die anästhesierte sechs Wochen alte weibliche CD1-Maus.
Lassen Sie das Peptid für den vorgegebenen versuchsreichen Zeitraum zirkulieren, bevor Sie die Maus mit einer Hochstrom-CO2-Kammer einschläfern und mit einer Schere die Brusthöhle öffnen und einen kleinen Nick in der seitlichen freien Wand des rechten Vorhofs machen. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Meter-Nadel ausgestattet ist, um drei Milliliter 10% gepuffertes Formalinphosphat durch die linksventrikuläre Spitze zu durchdringen, um das Gewebe zu fixieren und alle roten Blutkörperchen auszuspülen. Dann sammeln Sie Das Herz, die Lunge, die Leber, die Nieren, die Milz, den Groß- und Dünndarm, die Blase, die Eierstöcke oder hoden und das Gehirn in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte für die ex vivo optische Bildgebung.
Für die In-vivo-Bildgebung der CTP-Transduced-Bilder starten Sie die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf Initialisieren, um das System für die Bildgebung vorzubereiten. Öffnen Sie den Bildgebungsassistenten, und wählen Sie Fluoreszenz und Filterpaar aus. Klicken Sie auf Namen, Farbstoffe, Zyanid und Cy5, um die Anregungs- und Emissionsparameter festzulegen.
Und klicken Sie auf Manuelle Einstellungen, um die Belichtung auf eine Sekunde, das Binning auf klein, das F/Stop auf acht und das Sichtfeld auf 15 Zentimeter festzulegen. Klicken Sie auf Erfassen, und legen Sie den Ordner fest, in dem die Beispiele gespeichert werden sollen. Fügen Sie die entsprechenden experimentellen Informationen im Fenster Bildbeschriftungen bearbeiten hinzu, und klicken Sie auf OK. Das aufgenommene Bild wird angezeigt.
Stellen Sie die Geräte auf Strahlungswirkung s. Doppelklicken Sie auf das Bild, und klicken Sie auf Korrekturen und Adaptive Fluorescent Background Subtraction. Passen Sie die Schwelle an, um nur die interessierten Organe mit Violett abzudecken.
Alternativ können Sie mit der rechten Maustaste klicken und Crop Area auswählen, um ein Feld mit allen von Interesse interessierten Beispielen zu zeichnen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, übertragen Sie die Proben in Szintillationsfläschchen mit 10% gepuffertem Formalinphosphat in einem Volumen von mindestens 20 Mal so viel wie das Gewebe und lagern Sie die Gewebe bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt ist, für mindestens 48 Stunden. Um die Bilder zu quantifizieren, stellen Sie die Einheiten auf Strahlungseffizienz und die Region von Interesse auf vier mal drei.
Passen Sie das Feld Bereich von Interesse an, um alle Brunnen gleichmäßig abzudecken, und klicken Sie auf "Interessenbereiche messen". Klicken Sie dann auf Grid Region of Interest Measurements, um die Zellen des Interessenbereichs abzugleichen, und klicken Sie auf Exportieren, um die Daten in einer Text- oder CSV-Datei zu speichern. Wenn die Organe nach mindestens 48 Stunden ausreichend fixiert sind, übertragen Sie die Proben in Gewebeverarbeitungs- und Einbettkassetten und laden Sie die Kassetten in eine Gewebeverarbeitungsmaschine.
Stellen Sie den Prozessor so ein, dass das Gewebe wie angegeben mit Ethanol dehydriert wird, gefolgt von der Reinigung mit zwei 30-minütigen Xylol-Behandlungen und Paraffin-Infusion enden sie mit vier 30-minütigen Paraffin-Behandlungen. Entfernen Sie nach der letzten Paraffinbehandlung das Gewebe von der Verarbeitungsmaschine. Legen Sie die Gewebe in einzelne Metallformen und linie jede Form mit geschmolzenem Paraffin.
Legen Sie die Formen auf eine kalte Platte. Wenn das Paraffin am Boden der Form zu erstarren beginnt, legen Sie die Organe in das Paraffin. Wenn alle Organe platziert sind, legen Sie eine beschriftete Kassette als Unterlage auf die Form und überfüllen Sie die Formen mit geschmolzenem Paraffin.
Lassen Sie das Paraffin abkühlen, bis es fest ist, bevor Sie die Blöcke über Nacht bei minus 20 Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen ein Mikrotom mit einem Klingenwinkel von sechs Grad und einer Schnittdicke von 10 Mikrometern aufstellen und die Gewebeblöcke in das Mikrotom einbauen. Beginnen Sie mit dem Schneiden, bis Abschnitte, die das Gewebe enthalten, erhalten sind, und legen Sie die Blöcke nach unten in einem 38 Grad Celsius destillierten Wasserbad für fünf Minuten oder bis das Gewebe etwas Feuchtigkeit absorbiert hat.
Wenn ein dünner weißer Umriss des Gewebes im Block erscheint, legen Sie das Gewebe für 10 Minuten auf einen flachen Eisblock, bevor Sie es in der gleichen Ausrichtung an das Mikrotom zurückgeben, wie es gerade geladen wurde. Beginnen Sie mit dem Abrufen von Slices, sodass abgeschnittene Abschnitte lange Bänder mit jeweils sechs bis zehn Abschnitten bilden können. Um eine erfolgreiche Gewebesektionserfassung zu gewährleisten, halten Sie den Block hydratisiert.
Bringen Sie den Block auf das Eis zurück, wenn die Schnittqualität schlecht ist oder zu sinken beginnt. Entsorgen Sie suboptimale Paraffinbänder, bis ein hochwertiges Band von ausreichender Länge für einen Schlitten hergestellt wird. Verwenden Sie eine stumpfe Kante, um Qualitätsbänder in ein 38 Grad Celsius Wasserbad zu übertragen und lassen Sie die Abschnitte auf der Oberfläche des destillierten Wassers sitzen, bis sie sich nur glätten.
Die abgeflachten Abschnitte auf die Oberfläche eines sauberen Glasschlittens schwimmen und das Wachs 30 Minuten in einem 65-Grad-Celsius-Ofen schmelzen. Um die Dias zu entparaffinisieren, behandeln Sie die Proben dreimal mit Xylol für 10 Minuten pro Behandlung. Nach der letzten Xylol-Behandlung rehydrieren Sie das Gewebe mit fünfminütigen absteigenden Ethanol-Eintauchen, gefolgt von einem fünfminütigen Eintauchen in tris-gepufferte Saline.
Nachdem die Dias über Nacht trocknen können, montieren Sie die Abschnitte mit Abdeckungen und 125 Mikroliter Montagemedium, ergänzt durch DAPI, und trocknen Sie die Dias über Nacht vor Licht geschützt, bevor sie durch Fluoreszenzmikroskopie gezwitschert werden. Nach der Fixierung sind Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz und Gehirn von Versuchs- und Kontrolltieren in einer 12-Well-Platte für die ex vivo optische Fluoreszenz-Bildgebung angeordnet. Bei umwandlung der Zählungen in Strahlungseffizienz können die Fluoreszenzdaten für jeden Organsatz quantifiziert werden.
Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Organe Autofluoreszenz als Reaktion auf unterschiedliche Anregungswellenlängen zeigen. Kürzere Anregungswellenlängen wie verbessertegrüne fluoreszierende Proteine sind mit höheren Konzentrationen der Autofluoreszenz vor allem in der Leber und im Gehirn als weitrote oder nah-Infrarot Anregung Wellenlängen verbunden. Formalin Fixierung und Paraffineinbettung von Gewebeabschnitten aus jedem Organ ermöglicht die immunfluorochemische Analyse von Zellmarkern von Interesse sowie die Quantifizierung von Immun- oder Stromalzellen von Interesse in jedem Gewebe.
Passen Sie die Bildeinstellungen an, um eine Sättigung zu vermeiden und Die Einstellungen nachzuverfolgen, und wenden Sie dann die gleichen Erfassungseinstellungen auf andere Stichproben im gleichen Experiment an, um Konsistenz und Genauigkeit zu erzielen. Immunhistochemie kann auch auf den Gewebeabschnitten durchgeführt werden, wenn ein Kandidat zelldurchdringendes Peptid mit einer Struktur oder einem Protein von Interesse kolokalisiert.
