Notre protocole nous permet de suivre la biodissuration et de confirmer l’internalisation spécifique aux tissus d’un peptide d’intérêt à l’aide de deux méthodologies distinctes mais complémentaires. Nous pouvons utiliser ce protocole pour maximiser les données obtenues à partir d’un seul animal et pour acquérir des données quantitatives d’imagerie par fluorescence axialle. En outre, nous pouvons obtenir des images qualitatives au microscope.
Après l’acquisition de C-terminus amide cap CTP synthétisés en phase solide avec un N-terminus étiqueté avec Cy5.5 à partir d’une installation de synthèse peptidique, faire un ou 10 millimolaire solution stock aliquot de CTP dans du sulfoxyde de diméthyle pour le stockage à moins 80 degrés Celsius protégé de la lumière. Le jour de l’expérience, chargez une dose de 10 milligrammes par kilogramme de Cy5,5 CTP dans 200 microlitres de PBS dans une seringue à insuline. Pesez une souris et livrez par voie intraveineuse le peptide dans la souris CD1 femelle anesthésiée de six semaines.
Laissez le peptide circuler pendant la période expérimentale prédécédée avant d’euthanasier la souris à l’aide d’une chambre de CO2 à débit élevé et d’utiliser des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique et faire une petite entaille dans la paroi latérale libre de l’atrium droit. Utilisez une seringue de cinq millilitres munie d’une aiguille de calibre 26 pour parcourir trois millilitres de phosphate de formaline tamponné à 10 % à travers l’apex ventriculaire gauche pour fixer les tissus et éliminer les globules rouges. Puis recueillir le cœur, le poumon, le foie, les reins, la rate, les intestins gros et grêles, la vessie, les ovaires ou les testicules, et le cerveau dans les puits individuels d’une plaque de 12 puits pour l’imagerie optique ex vivo.
Pour l’imagerie in vivo des images transduced CTP, démarrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur Initialize pour préparer le système à l’imagerie. Ouvrez l’assistant d’imagerie et sélectionnez Fluorescence et Filter Paire. Cliquez sur Noms, Dyes, Cyanure et Cy5 pour définir les paramètres d’excitation et d’émission.
Et cliquez sur Paramètres manuels pour définir l’exposition à une seconde, le binning à petit, le F / Stop à huit, et le champ de vision à 15 centimètres. Cliquez sur Acquérir et définir le dossier dans lequel enregistrer les échantillons. Ajoutez les informations expérimentales appropriées dans la fenêtre d’étiquettes d’image de modification et cliquez sur OK. L’image acquise apparaîtra.
Réglez les unités à l’efficacité radiante. Cliquez deux fois sur l’image et cliquez sur Corrections et Soustraction fluorescente adaptative de fond. Ajustez le seuil pour ne couvrir que les organes d’intérêt avec du violet.
Vous pouvez également cliquer à droite et sélectionner Crop Area pour dessiner une boîte contenant tous les échantillons d’intérêt. Lorsque toutes les images ont été acquises, transférez les échantillons dans des flacons de scintillation contenant du phosphate de formaline tamponné à 10 % dans un volume d’au moins 20 fois celui du tissu et stockez les tissus à température ambiante protégés de la lumière pendant au moins 48 heures. Pour quantifier les images, réglez les unités à l’efficacité rayonnante et la région d’intérêt à quatre par trois.
Ajustez la boîte de la région d’intérêt pour couvrir uniformément tous les puits et cliquez sur Mesurer les régions d’intérêt. Cliquez ensuite sur Grid Region of Interest Measurements pour faire correspondre les cellules de la région d’intérêt et cliquez sur Export pour enregistrer les données dans un fichier texte ou CSV. Lorsque les organes sont suffisamment fixés après un minimum de 48 heures, transférez les échantillons dans des cassettes de traitement des tissus et d’intégration et chargez les cassettes dans une machine de traitement des tissus.
Réglez le processeur pour déshydrater le tissu avec de l’éthanol comme indiqué, puis dégagez avec deux traitements de xylène de 30 minutes et infusion de paraffine avec quatre traitements de paraffine de 30 minutes. Après le dernier traitement paraffine, retirer les tissus de la machine de traitement. Placez les tissus dans des moules métalliques individuels et tapisser chaque moule de paraffine fondue.
Déposer les moules sur une assiette froide. Comme la paraffine au fond du moule commence à se solidifier, placez les organes dans la paraffine. Lorsque tous les organes ont été placés, placez une cassette étiquetée sur le dessus du moule comme support et remplissez les moules avec de la paraffine fondue.
Laisser refroidir la paraffine jusqu’à ce qu’elle soit solide avant de stocker les blocs à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, installez une microtome avec un angle de lame de six degrés et une épaisseur de section de 10 micromètres et montez les blocs de tissu dans la microtome. Commencez à couper jusqu’à ce que les sections contenant le tissu soient obtenues et placez les blocs face vers le bas dans un bain d’eau distillée de 38 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que le tissu ait absorbé un peu d’humidité.
Lorsqu’un mince contour blanc du tissu apparaît dans le bloc, placez le tissu sur un bloc de glace plat pendant 10 minutes avant de le retourner au microtome dans la même orientation qu’il vient d’être chargé. Commencez à obtenir des tranches permettant aux sections tronquées de former de longs rubans de six à 10 sections chacune. Pour assurer une acquisition réussie de la section tissulaire, gardez le bloc hydraté.
Retournez le bloc sur la glace si la qualité de la section est mauvaise ou si elle commence à diminuer. Jeter les rubans de paraffine sous-optimaux jusqu’à ce qu’un ruban de haute qualité d’une longueur suffisante pour couvrir une diapositive soit produit. Utilisez un bord émoussé pour transférer des rubans de qualité dans un bain d’eau de 38 degrés Celsius et laissez les sections reposer à la surface de l’eau distillée jusqu’à ce qu’elles se lisser.
Faire flotter les sections aplaties sur la surface d’une glissade de verre propre et faire fondre la cire dans un four de 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour déparaffiniser les diapositives, traiter les échantillons trois fois avec du xylène pendant 10 minutes par traitement. Après le dernier traitement au xylène, réhydrater les tissus avec des immersions descendantes de cinq minutes dans l’éthanol comme indiqué, suivies d’une immersion de cinq minutes dans la solution saline tamponnée par tris.
Après avoir laissé sécher les glissières pendant la nuit, montez les sections avec des coverslips et 125 microlitres de support de montage complétés par dapi et séchez les glissières pendant la nuit protégées de la lumière avant l’imagerie par microscopie de fluorescence. Après fixation, le cœur, les poumons, le foie, les reins, la rate et le cerveau des animaux expérimentaux et de contrôle sont disposés dans une plaque de 12 puits pour l’imagerie fluorescente optique ex vivo. Lors de la conversion des comptes à l’efficacité radiante, les données de fluorescence peuvent être quantifiées pour chaque ensemble d’organes.
Il est important de noter que différents organes démontrent l’auto-fluorescence en réponse à différentes longueurs d’onde d’excitation. Des longueurs d’onde d’excitation plus courtes telles que la protéine fluorescente verte améliorée sont associées à des niveaux plus élevés d’auto fluorescence, en particulier dans le foie et le cerveau que les longueurs d’onde d’excitation rouge lointain ou proche infrarouge. La fixation de formaline et l’intégration paraffine des sections tissulaires de chaque organe permettent l’analyse immunofluorochimique des marqueurs cellulaires d’intérêt ainsi que la quantification des cellules immunitaires ou stromales d’intérêt dans chaque tissu.
Ajustez les paramètres d’imagerie pour éviter la saturation et gardez une trace de vos paramètres, puis appliquez les mêmes paramètres d’acquisition à d’autres échantillons dans la même expérience pour plus de cohérence et de précision. L’immunohistochimie peut également être effectuée sur les sections tissulaires si un peptide candidat pénétrant dans les cellules se co-localise avec une structure ou une protéine d’intérêt.
