Nuestro protocolo nos permite realizar un seguimiento de la biodistribucción y confirmar la internalización específica del tejido de un péptido de interés utilizando dos metodologías separadas pero complementarias. Podemos utilizar este protocolo para maximizar los datos obtenidos de un solo animal y para adquirir datos cuantitativos de imágenes de fluorescencia axial. Además, podemos obtener imágenes cualitativas del microscopio.
Después de adquirir C-terminus amida capP sintetizado en fase sólida con un N-terminus etiquetado con Cy5.5 de una instalación de síntesis de péptidos, haga una solución de stock milimolar alícuota de CTP en sulfóxido de dimetil para almacenamiento a menos 80 grados Celsius protegido de la luz. El día del experimento, cargue una dosis de 10 miligramos por kilogramo de Cy5.5 CTP en 200 microlitros de PBS en una jeringa de insulina. Pesar un ratón y entregar por vía intravenosa el péptido en el ratón CD1 hembra anestesado de seis semanas de edad.
Permita que el péptido circule durante el período de tiempo experimental especificado previamente antes de eutanasiar el ratón usando una cámara de CO2 de alto flujo y usando tijeras para abrir la cavidad torácica y haciendo un pequeño nick en la pared libre lateral de la aurícula derecha. Utilice una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 26 para infunder tres mililitros de fosfato de formalina amortiguado al 10% a través del ápice ventricular izquierdo para fijar los tejidos y eliminar los glóbulos rojos. Luego recoja el corazón, pulmón, hígado, riñones, bazo, intestinos grandes y pequeños, vejiga, ovarios o testículos, y cerebro en pozos individuales de una placa de 12 pozos para imágenes ópticas ex vivo.
Para obtener imágenes in vivo de las imágenes transducidas CTP, inicie el software de adquisición de imágenes y haga clic en Inicializar para preparar el sistema para la creación de imágenes. Abra el asistente de imágenes y seleccione Fluorescencia y Par de filtros. Haga clic en Nombres, Tintes, Cianuro y Cy5 para establecer los parámetros de excitación y emisión.
Y haga clic en Configuración manual para establecer la exposición a un segundo, el binning en pequeño, el F/Stop a ocho y el campo de visión a 15 centímetros. Haga clic en Adquirir y establezca la carpeta en la que desea guardar los ejemplos. Agregue la información experimental adecuada en la ventana Editar etiquetas de imagen y haga clic en Aceptar. Aparecerá la imagen adquirida.
Ajuste las unidades a eficiencia radiante. Haga doble clic en la imagen y haga clic en Correcciones y Sustracción de fondo fluorescente adaptable. Ajuste el umbral para cubrir sólo los órganos de interés con púrpura.
Alternativamente, haga clic con el botón derecho y seleccione Área de recorte para dibujar un cuadro que contenga todas las muestras de interés. Una vez adquiridas todas las imágenes, transfiera las muestras a viales de centelleo que contengan fosfato de formalina 10% amortiguado en un volumen de al menos 20 veces el tejido y almacene los tejidos a temperatura ambiente protegidos de la luz durante al menos 48 horas. Para cuantificar las imágenes, establezca las unidades en eficiencia radiante y la región de interés en cuatro por tres.
Ajuste el cuadro de región de interés para cubrir uniformemente todos los pozos y haga clic en Medir regiones de interés. A continuación, haga clic en Mediciones de región de interés de cuadrícula para que coincidan con las celdas de la región de interés y haga clic en Exportar para guardar los datos en un archivo de texto o CSV. Cuando los órganos estén suficientemente fijados después de un mínimo de 48 horas, transfiera las muestras al procesamiento de tejidos y la incrustación de casetes y cargue los casetes en una máquina de procesamiento de tejidos.
Configure el procesador para deshidratar el tejido con etanol como se indica, seguido de la limpieza con dos tratamientos de xileno de 30 minutos y perfusión de parafina con cuatro tratamientos de parafina de 30 minutos. Después del último tratamiento con parafina, retire los tejidos de la máquina de procesamiento. Coloque los tejidos en moldes metálicos individuales y forme cada molde con parafina fundida.
Coloque los moldes sobre una placa fría. A medida que la parafina en la parte inferior del molde comienza a solidificarse, coloque los órganos en la parafina. Cuando se hayan colocado todos los órganos, coloque un cassette etiquetado en la parte superior del molde como respaldo y rellene en exceso los moldes con parafina fundida.
Deje que la parafina se enfríe hasta que quede sólida antes de almacenar los bloques a menos 20 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, configure un microtoma con un ángulo de hoja de seis grados y un espesor de sección de 10 micrómetros y monte los bloques de tejido en el microtoma. Comience a cortar hasta obtener secciones que contengan el tejido y coloque los bloques boca abajo en un baño de agua destilada de 38 grados Celsius durante cinco minutos o hasta que el tejido haya absorbido algo de humedad.
Cuando aparezca un contorno blanco delgado del tejido en el bloque, coloque el tejido en un bloque de hielo plano durante 10 minutos antes de devolverlo al microtomo en la misma orientación que se acaba de cargar. Comience a obtener sectores que permitan que las secciones truncadas formen cintas largas de seis a 10 secciones cada una. Para asegurar una adquisición exitosa de la sección de tejido, mantenga el bloque hidratado.
Devuelva el bloque al hielo si la calidad de la sección es deficiente o comienza a disminuir. Deseche cintas de parafina subóptimas hasta que se produzca una cinta de alta calidad de longitud suficiente para cubrir una diapositiva. Utilice un borde romo para transferir cintas de calidad en un baño de agua Celsius de 38 grados y deje que las secciones se sienten en la superficie del agua destilada hasta que se alisen.
Flotar las secciones aplanadas sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio limpio y derretir la cera en un horno Celsius de 65 grados durante 30 minutos. Para desparafinar los portaobjetos, trate las muestras tres veces con xileno durante 10 minutos por tratamiento. Después del último tratamiento con xileno, rehidrata los tejidos con inmersiones de etanol descendente de cinco minutos como se indica, seguida de una inmersión de cinco minutos en solución salina tris-buffered.
Después de permitir que las diapositivas se sequen durante la noche, monte las secciones con cubreobjetos y 125 microlitros de medio de montaje complementados con DAPI y seque los portaobjetos durante la noche protegidos de la luz antes de la toma de imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Después de la fijación, el corazón, los pulmones, el hígado, el riñón, el bazo y el cerebro de animales experimentales y de control están dispuestos en una placa de 12 pozos para imágenes fluorescentes ópticas ex vivo. Tras la conversión de los recuentos a la eficiencia radiante, los datos de fluorescencia se pueden cuantificar para cada conjunto de órganos.
Es importante tener en cuenta que diferentes órganos demuestran auto-fluorescencia en respuesta a diferentes longitudes de onda de excitación. Las longitudes de onda de excitación más cortas, como la proteína fluorescente verde mejorada, se asocian con mayores niveles de autofluorescencia, especialmente en el hígado y el cerebro, que las longitudes de onda de excitación de infrarrojo lejano o cercano. La fijación de formalina y la incrustación de parafina de secciones tisulares de cada órgano permiten el análisis inmunofluoroquímico de marcadores celulares de interés, así como la cuantificación de células inmunitarias o estromales de interés dentro de cada tejido.
Ajuste la configuración de imágenes para evitar la saturación y realizar un seguimiento de la configuración y, a continuación, aplique la misma configuración de adquisición a otras muestras del mismo experimento para obtener consistencia y precisión. La inmunohistoquímica también se puede realizar en las secciones de tejido si un péptido de penetración celular candidato co-localiza con una estructura o proteína de interés.
