Protokolümüz biyo-dağılımı izlememize ve iki ayrı ama tamamlayıcı metodoloji kullanarak bir ilgi peptidin dokuya özgü içselizasyonunu doğrulamamıza olanak sağlar. Bu protokolü, tek bir hayvandan elde edilen verileri en üst düzeye çıkarmak ve nicel eksenel floresan görüntüleme verilerini elde etmek için kullanabiliriz. Ayrıca, nitel mikroskop görüntüleri elde edebilirsiniz.
Bir peptid sentez tesisinden Cy5.5 ile etiketlenmiş bir N-terminus ile katı faz sentezlenmiş C-terminus amid kap CTPs elde ettikten sonra, eksi 80 santigrat derece ışıktan korunan depolama için dimetil sülfoksit CTP bir veya 10 milimolar stok çözeltisi aliquot olun. Deney günü, bir insülin şırınga içine PBS 200 mikrolitre Cy5.5 CTP kilogram doz başına 10 miligram yükleyin. Bir fare tartın ve intravenöz anestezi altı haftalık kadın CD1 fare içine peptid teslim.
Yüksek akışlı CO2 odası nı kullanarak fareyi ötenazi yapmadan ve göğüs boşluğunu açmak ve sağ atriyumun lateral serbest duvarında küçük bir çentik yapmak için makas kullanmadan önce peptidin önceden belirlenmiş deneysel zaman dilimi boyunca dolaşmasına izin verin. Dokuları düzeltmek ve herhangi bir kırmızı kan hücrelerini temizlemek için sol ventrikül apeksi üzerinden% 10 tamponlu formalin fosfat üç mililitre perpin için 26 gauge iğne ile donatılmış beş mililitreşşüş kullanın. Sonra kalp toplamak, akciğer, karaciğer, böbrekler, dalak, kalın ve ince bağırsaklar, mesane, yumurtalıklar veya testisler, ve eski vivo optik görüntüleme için 12-iyi plaka bireysel kuyular içine beyin.
CTP transduced görüntülerin vivo görüntüleme için, görüntü edinme yazılımı başlatmak ve görüntüleme için sistem hazırlamak için Initialize tıklayın. Görüntüleme sihirbazını açın ve Floresan ve Filtre Çifti'ni seçin. Uyarma ve emisyon parametrelerini ayarlamak için Adlar, Boyalar, Siyanür ve Cy5'i tıklatın.
Pozlamayı bir saniyeye, binning'i küçüklere, F/Stop'u sekize ve görüş alanını 15 santimetreye ayarlamak için Manuel Ayarlar'ı tıklatın. Örnekleri kaydetmek için Satın Al'ı ve klasörü ayarla'yı tıklatın. Görüntü etiketleri edin penceresinde uygun deneysel bilgileri ekleyin ve Tamam'ı tıklatın. Edinilen görüntü görüntülenir.
Üniteleri radyant verimliliğe ayarlayın. Resmi çift tıklatın ve Düzeltmeler ve Uyarlanabilir Floresan Arka Plan Çıkarma'yı tıklatın. Sadece ilgi çeken organları mor ile kapsayacak şekilde eşiği ayarlayın.
Alternatif olarak, ilgi çekici tüm örnekleri içeren bir kutu çizmek için Kırpma Alanı'nı sağ tıklatın ve seçin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, numuneleri dokudan en az 20 kat daha fazla tamponlu formalin fosfat içeren sintilasyon şişelerine aktarın ve dokuları ışıktan en az 48 saat boyunca korunan oda sıcaklığında saklayın. Görüntüleri ölçmek için, birimleri radyant verimliliğe ve ilgi bölgesini üçe dört olarak ayarlayın.
İlgi alanı kutusunun bölgesini tüm kuyuları eşit olarak kapsayacak şekilde ayarlayın ve İlgi Bölgelerini Ölç'ü tıklatın. Ardından, ilgi çeken bölgenin hücrelerini eşleştirmek için İlgi Alanı Ölçümlerini Izgara'yı tıklatın ve verileri bir metin veya CSV dosyasına kaydetmek için Dışa Aktar'ı tıklatın. Organlar en az 48 saat sonra yeterince sabitlendiğinde, örnekleri doku işleme ve kasetlere aktarın ve kasetleri bir doku işleme makinesine yükleyin.
Belirtildiği gibi etanol ile doku dehydrate için işlemci ayarlayın, iki 30 dakikalık ksilen tedavileri ve parafin infüzyonu ile dört 30 dakikalık parafin tedavileri ile temizlenmesi izledi. Son parafin tedavisinden sonra, işleme makinesinden dokuları çıkarın. Tek tek metal kalıplar dokuları yerleştirin ve erimiş parafin ile her kalıp hattı.
Kalıpları soğuk bir tabağa yerleştirin. Kalıbın altındaki parafin katılaşmaya başladığında, organları parafinin içine yerleştirin. Tüm organlar yerleştirildiğinde, kalıp üzerine bir destek olarak etiketli bir kaset yerleştirin ve erimiş parafin ile kalıpları aşırı doldurun.
Parafinin blokları bir gecede eksi 20 derecede saklamadan önce katı kadar soğumasını bekleyin. Ertesi sabah, altı derecelik bir bıçak açısı ve 10 mikrometrelik bir kesit kalınlığı na sahip bir mikrotom ayarlayın ve doku bloklarını mikrotome monte edin. Doku içeren kesitler elde edilene kadar kesmeye başlayın ve blokları 38 derece santigrat derece distile su banyosuna beş dakika veya doku biraz nem emilene kadar yüzüstü yerleştirin.
Bloğun içinde dokunun ince beyaz bir anahattı göründüğünde, sadece yüklendiği gibi mikrotome dönmeden önce 10 dakika boyunca düz bir buz bloğu üzerine doku yerleştirin. Kesilen bölümlerin her biri altı ila 10 bölümden oluşan uzun şeritler oluşturmasına izin veren dilimler edinmeye başlayın. Başarılı bir doku bölümü edinimi sağlamak için, blok sulu tutun.
Bölüm kalitesi düşükse veya düşmeye başlarsa bloğu buzun acıda geri döndürün. Bir slayt ı kapsayacak kadar yeterli uzunlukta yüksek kaliteli bir şerit üretilene kadar suboptimal parafin şeritler atın. Kaliteli kurdeleleri 38 derecelik bir su banyosuna aktarmak için künt bir kenar kullanın ve bölümlerin düzene kadar distile suyun yüzeyinde durmasına izin verin.
Temiz bir cam slayt yüzeyine düzleştirilmiş bölümleri float ve 30 dakika boyunca 65 derece santigrat fırında balmumu eritin. Slaytları ayırmak için, örnekleri tedavi başına 10 dakika ksilen ile üç kez tedavi edin. Son ksilen tedavisinden sonra, belirtildiği gibi beş dakikalık inen etanol daldırma ile dokuları rehydrate, tris-tamponlu salin beş dakikalık bir daldırma takip.
Slaytların bir gecede kurumasını sağladıktan sonra, kesitleri kapaklı ve DAPI ile takviye edilmiş 125 mikrolitre montaj ortamıile monte edin ve floresan mikroskopi ile görüntülemeden önce slaytları bir gecede ışıktan koruyun. Fiksasyon dan sonra, kalp, akciğerler, karaciğer, böbrek, dalak, ve beyin deneysel ve kontrol hayvanlarından ex vivo optik floresan görüntüleme için 12-iyi plaka içinde düzenlenir. Sayıların radyant verime dönüştürülmesi üzerine, floresan verileri her organ kümesi için ölçülebilir.
Farklı organların farklı uyarma dalga boylarına yanıt olarak oto-floresan gösterdiğini belirtmek önemlidir. Gelişmiş yeşil floresan protein gibi kısa uyarma dalga boyları uzak-kırmızı veya yakın kızılötesi uyarma dalga boyları daha karaciğer ve beyin özellikle oto-floresan yüksek düzeyde ilişkilidir. Formalin fiksasyonu ve her organdan doku bölümleri parafin gömme ilgi hücre belirteçleri immünflorokimyasal analiz yanı sıra her doku içinde ilgi bağışıklık veya stromal hücrelerin in nicel sağlar.
Doygunluğu önlemek ve ayarlarınızı takip etmek için görüntüleme ayarlarını ayarlayın ve tutarlılık ve doğruluk için aynı denemedeki diğer örneklere aynı kazanım ayarlarını uygulayın. Bir aday hücre delici peptid ilgi bir yapı veya protein ile birlikte lokalize ise immünohistokimya da doku bölümleri üzerinde yapılabilir.
