Наш протокол позволяет нам отслеживать биораспределеть и подтверждать ткани-специфической интернализации пептида интереса с помощью двух отдельных, но дополнительных методологий. Мы можем использовать этот протокол для максимизации данных, полученных от одного животного, и для получения количественных данных оксиальной флуоресценции. Кроме того, мы можем получить качественные изображения микроскопа.
После приобретения твердой фазы синтезированных C-терминус amide крышка CTPs с N-терминуса помечены Cy5.5 из пептидного синтеза объекта, сделать один или 10 миллимоляйных фондовых раствор aliquot CTP в диметил сульфоксид для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию защищены от света. В день эксперимента загрузите 10 миллиграмм на килограмм дозы Cy5.5 CTP в 200 микролитров PBS в инсулиновый шприц. Взвесить мышь и внутривенно доставить пептид в анестезировали шестинедельной самки cd1 мыши.
Разрешить пептид циркулировать в течение заранее определенного экспериментального периода времени, прежде чем усыпение мыши с помощью высокотекутной камеры CO2 и с помощью ножниц, чтобы открыть полость грудной клетки и сделать небольшой ник в боковой свободной стенке правого предгория. Используйте пятими миллилитр шприц оснащен 26 калибровочных иглы для очертить три миллилитров 10%buffered формалин фосфат через левый желудочковой вершины, чтобы исправить ткани и избавиться от любых красных кровяных телец. Затем соберите сердце, легкие, печень, почки, селезенку, толстой и тонкой кишки, мочевого пузыря, яичников или яище, и мозг в отдельных скважин 12-хорошо пластины для ex vivo оптической визуализации.
Для визуализации изображений, индуцированных CTP, запустите программное обеспечение для получения изображений и нажмите Initialize, чтобы подготовить систему к визуализации. Откройте мастер изображений и выберите флуоресценцию и фильтровальную пару. Нажмите Имена, красители, цианид, и Cy5, чтобы установить возбуждение и параметры выбросов.
И нажмите Ручные настройки, чтобы установить экспозицию на одну секунду, биннинг для малых, F / Стоп до восьми, и поле зрения до 15 сантиметров. Нажмите Приобрести и установить папку, в которой для сохранения образцов. Добавьте соответствующую экспериментальную информацию в окно меток изображений редактирования и нажмите OK. Приобретенное изображение появится.
Установите блоки для сияющей эффективности. Дважды щелкните изображение и нажмите Исправления и адаптивные флуоресцентные фоновое вычитание. Отрегулируйте порог, чтобы покрыть фиолетовым только органы, представляющие интерес.
Кроме того, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Crop Area, чтобы нарисовать коробку, содержащую все образцы, представляющие интерес. Когда все изображения были приобретены, передать образцы в сцинтилляционные флаконы, содержащие 10%buffered формалин фосфат в объеме, по крайней мере в 20 раз больше, чем ткани и хранить ткани при комнатной температуре защищены от света, по крайней мере 48 часов. Для количественной оценки изображений установите единицы для сияющей эффективности и области интереса до четырех на три.
Отрегулируйте область процентной коробки, чтобы равномерно покрыть все скважины и нажмите Мера Регионы интересов. Затем нажмите Grid Region of Interest Measurements, чтобы соответствовать ячейкам области интересов, и нажмите Export, чтобы сохранить данные в текстовом или CSV-файле. Когда органы будут достаточно исправлены в течение как минимум 48 часов, перенесите образцы в обработку тканей и встраивание кассет и загрузите кассеты в машину обработки тканей.
Установите процессор для обезвоживания ткани с этанолом, как указано, а затем очистка с двумя 30-минутные процедуры ксилена и парафина инфузии с четырьмя 30-минутный парафин лечения. После последнего парафинового лечения удалите ткани из перерабатывающей машины. Поместите ткани в отдельные металлические формы и линии каждой формы с расплавленным парафином.
Поместите формы на холодную тарелку. Как парафин в нижней части формы начинает затвердевать, поместите органы в парафин. Когда все органы были помещены, место помечены кассеты на верхней части формы в качестве поддержки и переполнения формы с расплавленным парафином.
Дайте парафину остыть до твердого тела перед хранением блоков при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь. На следующее утро установите микротому с углом лезвия в шесть градусов и толщиной в 10 микрометров и установите блоки тканей в микротому. Начните резки до тех пор, пока разделы, содержащие ткани получены и место блоков лицом вниз в 38 градусов по Цельсию дистиллированной водяной бане в течение пяти минут или до тех пор, пока ткань впитала влагу.
Когда тонкий белый контур ткани появляется в блоке, поместите ткань на плоскую ледяную глыму в течение 10 минут, прежде чем вернуть ее в микротом в той же ориентации, что и только что загруженная. Начните получать ломтики, позволяющие усеченным секциям формировать длинные ленты от шести до 10 секций каждый. Чтобы обеспечить успешное приобретение секции тканей, держите блок увлажненным.
Верните блок на лед, если качество секции плохое или начнет снижаться. Откажитесь от неоптимальных парафиновых лент до тех пор, пока не будет изготовлена высококачественная лента достаточной длины для покрытия слайда. Используйте тупой край для передачи качества ленты в 38 градусов по Цельсию водяной бане и пусть разделы сидеть на поверхности дистиллированной воды, пока они просто сгладить.
Поплавок сплющенные разделы на поверхность чистого стекла слайд и растопить воск в 65 градусов по Цельсию духовке в течение 30 минут. Чтобы депарафинизировать слайды, обработать образцы три раза с ксиленом в течение 10 минут за лечение. После последнего лечения ксиленом регидратировать ткани с пятиминутным нисходящим погружением этанола, как указано, а затем пятиминутное погружение в трис-буферный солевой раствор.
После того, как слайды высохнут на ночь, смонтировать секции с крышками и 125 микролитров монтажной среды, дополненной DAPI, и высушить горки, на ночь защищенные от света перед визуализацией с помощью микроскопии флуоресценции. После фиксации, сердце, легкие, печень, почки, селезенка, и мозг от экспериментальных и контрольных животных расположены в 12-хорошо пластины для ex vivo оптических флуоресцентных изображений. При преобразовании графов в сияющую эффективность данные о флуоресценции могут быть количественно определены для каждого набора органов.
Важно отметить, что различные органы демонстрируют аутофлуоресценцию в ответ на различные длины волн возбуждения. Более короткие длины волн возбуждения, такие как улучшенный зеленый флуоресцентный белок, связаны с более высоким уровнем аутофлуоресценции, особенно в печени и мозге, чем далеко-красные или почти инфракрасные длины волн возбуждения. Формалин фиксации и парафина встраивания тканевых секций из каждого органа позволяет иммунофторохимический анализ клеточных маркеров интерес, а также количественной оценки иммунных или стромальных клеток, представляющих интерес в каждой ткани.
Отрегулируйте настройки изображения, чтобы избежать насыщения и отслеживать настройки, а затем применить те же настройки приобретения к другим образцам в том же эксперименте для согласованности и точности. Иммуногистохимия также может быть выполнена на секциях тканей, если кандидат клеточного пептида ко-локализуется со структурой или белка интереса.
