当社のプロトコルは、バイオ分布を追跡し、2つの別々の補完的な方法論を使用して、関心のあるペプチドの組織特異的な内在化を確認することを可能にします。このプロトコルを使用して、単一の動物から得られたデータを最大化し、定量的な軸方向蛍光イメージングデータを取得することができます。また、定性顕微鏡画像を取得することができます。
ペプチド合成施設からCy5.5で標識されたN末語を有するC末頭蓋キャップCtPを固相合成した後、光から保護されたマイナス80°Cで貯蔵するためにジメチルスルホキシド中のCTPの1ミリモルまたは10ミリモルのストック溶液アリコートを作る。実験当日、1キログラム当たり10ミリグラムのCy5.5 CTPを200マイクロリットルのPBSでインスリン注射器にロードする。マウスの重量を量り、麻酔後6週間の雌CD1マウスにペプチドを静脈内に送達する。
ペプチドは、高流量CO2チャンバーを使用してマウスを安楽死させる前に、事前に指定された実験期間に循環させ、ハサミを使用して胸腔を開き、右心房の側面のない壁に小さなニックを作ります。26ゲージ針を装備した5ミリリットルのシリンジを使用して、左心室の頂点を通して10%緩衝されたホルマリンリンの3ミリリットルを浸透させ、組織を固定し、赤血球を洗い流します。次に、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、大腸および小腸、膀胱、卵巣または精巣、および脳を、ex vivo光学画像用の12ウェルプレートの個々の井戸に集める。
CTP の導入イメージの in vivo イメージングの場合は、イメージ取得ソフトウェアを起動し、[初期化] をクリックして、イメージング用のシステムを準備します。イメージング ウィザードを開き、[蛍光とフィルタ ペア] を選択します。励起パラメータと放出パラメータを設定するには、[名前]、[染料]、[シアン化物]、[Cy5]をクリックします。
[手動設定]をクリックして、露出を 1 秒、ビンを小さく、F/ストップを 8 に、視野を 15 センチメートルに設定します。[取得] をクリックし、サンプルを保存するフォルダを設定します。[イメージ ラベルの編集] ウィンドウに適切な実験情報を追加し、[OK] をクリックします。取得した画像が表示されます。
単位を放射効率に設定します。画像をダブルクリックし、[補正]および[適応蛍光背景引き算]をクリックします。紫色で関心のある臓器のみをカバーするようにしきい値を調整します。
または、右クリックして[トリミング領域]を選択し、すべてのサンプルを含むボックスを描画します。すべての画像が取得されたら、サンプルを組織の少なくとも20倍の体積で10%緩衝されたホルマリンリンを含むシンチレーションバイアルに移し、少なくとも48時間光から保護された室温で組織を貯蔵する。画像を定量化するには、単位を放射効率に、対象領域を 4 つずつに設定します。
すべてのウェルを均等に覆う対象領域ボックスを調整し、[対象地域の測定] をクリックします。次に、[対象となる領域のグリッド領域] をクリックして対象地域のセルと一致させ、[エクスポート] をクリックして、テキストファイルまたは CSV ファイルにデータを保存します。臓器が48時間以上経過した後に十分に固定されている場合は、サンプルを組織処理および埋め込みカセットに移し、カセットを組織処理機にロードします。
示されているようにエタノールで組織を脱水するようにプロセッサを設定し、続いて4つの30分パラフィン治療で2つの30分キシレン治療とパラフィン注入でクリアします。最後のパラフィン処理後、加工機から組織を取り除きます。個々の金属鋳型に組織を配置し、溶融パラフィンで各金型を並べます。
金型を冷たいプレートに置きます。カビの底にあるパラフィンが固まり始めると、臓器をパラフィンに入れます。すべての臓器を配置したら、標識されたカセットを型の上にバッキングとして配置し、モールドに溶融パラフィンをオーバーフィルします。
パラフィンを固体になるまで冷ましてから、ブロックをマイナス20度で一晩保存します。翌朝、6度の刃角と10マイクロメートルの断面厚さのミクロトームを設置し、組織ブロックをミクロトームに取り付けます。組織を含む切片が得られるまで切断を開始し、ブロックを38°Cの蒸留水浴に下に置き、5分間、または組織が水分を吸収するまで切断します。
組織の薄い白い輪郭がブロックに現れた場合は、組織を平らな氷のブロックに10分間置き、ちょうどロードしたのと同じ方向でミクロトームに戻します。切り捨てられたセクションをそれぞれ 6 ~ 10 セクションの長いリボンとして形成できるスライスの取得を開始します。組織セクションの取得を成功させるために、ブロックを水分補給してください。
セクションの品質が悪い場合や、不良を開始した場合は、ブロックを氷に戻します。滑り台を覆うのに十分な長さの良質のリボンが作られるまで、最適以下のパラフィンリボンを捨てます。38°Cの水浴に高品質のリボンを転送し、セクションがちょうど滑らかになるまで蒸留水の表面に座らせるために鈍いエッジを使用してください。
平らにした部分をきれいなガラススライドの表面に浮かけ、ワックスを65度の摂氏オーブンで30分間溶かします。スライドを脱パラフィン化するには、1回の処理で10分間、キシレンでサンプルを3回処理します。最後のキシレン処理の後、示されているように5分間の降水エタノール浸漬で組織を水分補給し、続いてトリスバッファー塩分に5分間浸漬します。
スライドを一晩乾燥させた後、DAPIを補充したカバースリップと125マイクロリットルの取り付け媒体でセクションを取り付け、蛍光顕微鏡でイメージングする前に一晩光から保護されたスライドを乾燥させます。固定後、実験動物および制御動物からの心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および脳を、ex vivo光学蛍光イメージング用の12ウェルプレートに配置する。カウントを放射効率に変換すると、各臓器セットについて蛍光データを定量化することができます。
異なる器官が異なる励起波長に応答して自己蛍光を発揮することに注意することが重要です。緑色蛍光タンパク質などの短い励起波長は、遠赤色または近赤外励起波長よりも肝臓および脳において特に高いレベルの自己蛍光と関連している。各器官からの組織切片のホルマリン固定およびパラフィン埋め込みは、目的の細胞マーカーの免疫フルオロケミカル分析と、各組織内の目的の免疫細胞または間質細胞の定量を可能にする。
イメージの設定を調整して、飽和を避け、設定を追跡し、同じ実験で同じサンプルに同じ取得設定を適用して、一貫性と正確性を得ます。免疫組織化学は、細胞透過ペプチド候補が目的の構造またはタンパク質と共局化する場合にも、組織切片に対して行うことができる。
