Nosso protocolo nos permite rastrear a bioco distribuição e confirmar a internalização específica do tecido de um peptídeo de interesse usando duas metodologias separadas, mas complementares. Podemos usar este protocolo para maximizar os dados obtidos de um único animal e adquirir dados quantitativos de imagem de fluorescência axial. Além disso, podemos obter imagens qualitativas de microscópio.
Depois de adquirir CTPs de mide cap de fase sólida sintetizadas com um termo N-terminus rotulado com Cy5.5 de uma instalação de síntese de peptídeos, faça uma alíquota de solução de um ou 10 milmolares de CTP em sulfóxido de dimetil para armazenamento a menos 80 graus Celsius protegido da luz. No dia do experimento, carregue uma dose de 10 miligramas por quilograma de Cy5.5 CTP em 200 microliters de PBS em uma seringa de insulina. Pesar um rato e entregar o peptídeo intravenosamente no rato CD1 feminino anestêmido de seis semanas de idade.
Permita que o peptídeo circule pelo período experimental pré-especificado antes de eutanásia do mouse usando uma câmara de CO2 de alto fluxo e usando uma tesoura para abrir a cavidade torácica e fazendo um pequeno corte na parede livre lateral do átrio direito. Use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha calibre 26 para permear três mililitros de fosfato formalina 10% tamponado através do ápice ventricular esquerdo para fixar os tecidos e para expelir quaisquer glóbulos vermelhos. Em seguida, colete o coração, pulmão, fígado, rins, baço, intestinos grandes e pequenos, bexiga, ovários ou testículos, e cérebro em poços individuais de uma placa de 12 poços para imagem óptica ex vivo.
Para imagens in vivo das imagens transduzidas ctp, inicie o software de aquisição de imagens e clique em Iniciar para preparar o sistema para imagem. Abra o assistente de imagem e selecione Fluorescência e Pares de filtros. Clique em Nomes, Corantes, Cianeto e Cy5 para definir os parâmetros de excitação e emissão.
E clique em Configurações Manuais para definir a exposição em um segundo, o binning para pequeno, o F/Stop para oito e o campo de visão para 15 centímetros. Clique em Adquirir e defina a pasta para salvar as amostras. Adicione as informações experimentais apropriadas na janela de etiquetas de imagem de edição e clique em OK. A imagem adquirida aparecerá.
Defina as unidades para uma eficiência radiante. Clique duas vezes na imagem e clique em Correções e Subtração de Fundo Fluorescente Adaptável. Ajuste o limiar para cobrir apenas os órgãos de interesse com roxo.
Alternativamente, clique com o botão direito do mouse e selecione Área de Cultura para desenhar uma caixa contendo todas as amostras de interesse. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, transfira as amostras para frascos de cintilação contendo fosfato formalina 10% tamponado em um volume de pelo menos 20 vezes o do tecido e armazene os tecidos à temperatura ambiente protegidos da luz por pelo menos 48 horas. Para quantificar as imagens, defina as unidades como eficiência radiante e a região de interesse para quatro por três.
Ajuste a caixa de interesse da região para cobrir uniformemente todos os poços e clique em Medir Regiões de Interesse. Em seguida, clique em Grades Região de Interesse para corresponder às células da região de interesse e clique em Exportar para salvar os dados em um texto ou arquivo CSV. Quando os órgãos estiverem suficientemente fixos após um mínimo de 48 horas, transfira as amostras para o processamento de tecidos e incorpore e carregue as fitas em uma máquina de processamento de tecidos.
Defina o processador para desidratar o tecido com etanol como indicado, seguido de compensação com dois tratamentos de xileno de 30 minutos e infusão de parafina com quatro tratamentos de parafina de 30 minutos. Após o último tratamento de parafina, remova os tecidos da máquina de processamento. Coloque os tecidos em moldes metálicos individuais e forque cada molde com parafina derretida.
Coloque os moldes em uma placa fria. À medida que a parafina no fundo do molde começa a se solidificar, coloque os órgãos na parafina. Quando todos os órgãos tiverem sido colocados, coloque uma fita rotulada em cima do molde como apoio e enchia demais os moldes com parafina derretida.
Deixe a parafina esfriar até ficar sólida antes de armazenar os blocos a menos 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, configure um microtómeo com um ângulo de lâmina de seis graus e uma espessura de seção de 10 micrômetros e monte os blocos de tecido no microtome. Comece a cortar até que as seções que contenham o tecido sejam obtidas e coloque os blocos de frente para baixo em um banho de água destilado de 38 graus Celsius por cinco minutos ou até que o tecido tenha absorvido alguma umidade.
Quando um contorno branco fino do tecido aparecer no bloco, coloque o tecido em um bloco de gelo plano por 10 minutos antes de devolvê-lo ao microtome na mesma orientação que estava apenas carregado. Comece a obter fatias permitindo que seções truncadas formem fitas longas de seis a 10 seções cada. Para garantir uma aquisição bem sucedida da seção de tecidos, mantenha o bloco hidratado.
Devolva o bloco ao gelo se a qualidade da seção estiver ruim ou começar a declinar. Descarte fitas de parafina subótimas até que uma fita de alta qualidade de comprimento suficiente para cobrir um slide seja produzida. Use uma borda sem corte para transferir fitas de qualidade para um banho de água de 38 graus Celsius e deixe as seções sentarem na superfície da água destilada até que elas simplesmente sualizem.
Flutue as seções achatadas sobre a superfície de um escorregador de vidro limpo e derreta a cera em um forno Celsius de 65 graus por 30 minutos. Para desparafinar os slides, trate as amostras três vezes com xileno por 10 minutos por tratamento. Após o último tratamento de xileno, reidratar os tecidos com imersões de etanol descendente de cinco minutos, como indicado, seguido de uma imersão de cinco minutos em soro fisiológico tris-tampão.
Depois de permitir que os slides sequem durante a noite, monte as seções com tampas e 125 microliters de meio de montagem complementados com DAPI e seque os slides durante a noite protegidos da luz antes da imagem por microscopia de fluorescência. Após a fixação, o coração, pulmões, fígado, rim, baço e cérebro de animais experimentais e de controle são dispostos em uma placa de 12 poços para imagem fluorescente óptica ex vivo. Após a conversão das contagens para eficiência radiante, os dados de fluorescência podem ser quantificados para cada conjunto de órgãos.
É importante notar que diferentes órgãos demonstram auto-fluorescência em resposta a diferentes comprimentos de onda de excitação. Comprimentos de onda de excitação mais curtos, como a proteína fluorescente verde aprimorada, estão associados a níveis mais altos de auto-fluorescência especialmente no fígado e no cérebro do que comprimentos de onda de excitação muito vermelhos ou quase infravermelhos. A fixação formalina e a incorporação de parafinas de seções teciduais de cada órgão permitem a análise imunofluoroquímica de marcadores celulares de interesse, bem como a quantificação de células imunes ou estromicanas de interesse dentro de cada tecido.
Ajuste as configurações de imagem para evitar saturação e acompanhe suas configurações e, em seguida, aplique as mesmas configurações de aquisição a outras amostras no mesmo experimento para consistência e precisão. A imunohistoquímica também pode ser realizada nas seções teciduais se um peptídeo penetrante de células candidato co-localiza com uma estrutura ou proteína de interesse.
