يهدف هذا البروتوكول إلى تبسيط إعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة ذات المدخلات المنخفضة من الأجنة المبكرة لتحديد بدقة الحمض النووي الصغير الذي ينظم النمو الجنيني. وميزة هذه التقنية هي أنها تتجنب تجميع عينات المدخلات المنخفضة ويمكن تطبيقها بسهولة على كل من الخلايا غير المفرزة والمرتبة. كما نظهر التدريج الدقيق للجنين لتجنب المتغيرات بين النسخ المتماثلة.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على الدراسات الزمنية والوراثية والتنموية أو التطبيقات الأخرى التي تكون فيها تركيزات الحمض النووي الريبي منخفضة. في المستقبل، يمكن استخدام هذه الطريقة لتشخيص اضطرابات النمو التي يتم فيها خلل التنظيم الدقيق. الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا البروتوكول هو تشريح الجنين.
لأنه يجب تشريح كل جنين، مرحلة، صورة، ومن ثم فصل بسرعة لضمان صلاحية الخلية. لتشريح الأجنة، شطف الرحم من فأر أنثى حامل مع برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بلاستيكي معقمة 10 سنتيمترات. استخدام مقص microdissection لفصل المنطقة التي تحتوي على decidua وتقشير قبالة عضلات الرحم لفضح جميع decidua.
لتشريح الأجنة، شطف الرحم من فأر أنثى حامل مع برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بلاستيكي معقمة 10 سنتيمترات. استخدام مقص microdissection لفصل المنطقة التي تحتوي على decidua. نقل جميع الأجنة في طبق جديد مع برنامج تلفزيوني نظيفة واتخاذ صورة للقمامة بأكملها.
ثم قم بـتصوّر كل جنين على حدة، ثم عد عدد الـ somites، مع الحفاظ على التكبير والتعرض ثابتًا بين التجارب. بالنسبة للأجنة الأكبر عمرًا من E8.0 ، قطع الرأس فوق الرمز البريدي otic ونقل الرأس إلى بئر نظيفة من لوحة 48 بئرًا. إضافة 250 ميكرولترات من الباباين إلى البئر والماصة صعودا وهبوطا بلطف.
استخدام المجهر للتحقق من وجود كتل ومواصلة الأنابيب صعودا وهبوطا حتى يتحقق تعليق خلية واحدة. ثم إضافة 250 ميكرولترات من FBS إلى الخلايا وتصفية 500 ميكرولترات من التعليق من خلال مرشح شبكة النايلون 35 ميكرومتر. نقل الترشيح إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وتدور عليه في 200 × ز لمدة خمس دقائق.
نقل فائقة إلى أنبوب جديد، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مع BSA. عندما تكون جاهزة لفرز تصفية الخلايا مرة أخرى من خلال أنبوب غطاء عامل التصفية وإضافة DAPI إلى وصمة عار الخلايا الحية. استخدام فارز الخلية مع فوهة 70 ميكرومتر لفرز كل عينة في 500 ميكرولترات من محلول استخراج الحمض النووي الريبي، ثم مزيج وتخزين العينة في 80 درجة مئوية سالبة.
إضافة خمسة microliters من 6X صبغة التحميل إلى كل عينة ومزيج عن طريق pipetting. تحميل العينات على 6٪ من هلام بولياكريلاميد TBE بدءا من هذا الأخير في البئر الأول وترك حارة واحدة بين كل عينة. تشغيل الجل في 150 فولت لمدة 30 إلى 40 دقيقة في 0.5X TBE تشغيل العازلة.
عندما ينتهي الجل من التشغيل، قم بإزالته بعناية من الألواح الزجاجية وضعه في الدرج من عبوته الأصلية، مع الإشارة إلى الاتجاه. إزالة المخزن المؤقت تشغيل وصمة عار هلام لمدة 15 دقيقة. ثم صوره على مضيء عبر الأشعة فوق البنفسجية.
تحديد الفرقة في 150 قاعدة أزواج واستخدام شفرة الحلاقة نظيفة لمعالجة ذلك. التأكد من تجنب محول خافتر المنتج في أزواج قاعدة 130. وضع شرائح هلام في أنابيب microcentrifuge وتدور عليها في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية.
بعد ذلك، استخدم نصيحة P200 لسحق شريحة الجل إلى أصغر بت ممكنة وإخراج الطرف في الأنبوب. إضافة 300 ميكرولترات من عازلة elution إلى كل أنبوب، وغسل بت هلام من الجانب. أعد توصيل طرف الماصات واغسله قبل إزالته من الأنبوب.
احتضان العينات بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية مع 1،000 دورة في الدقيقة تهتز. في اليوم التالي، تدور عليها في أقصى سرعة لمدة 10 دقائق ونقل فائقة إلى لوحة 96-well خالية من RNase. إضافة 50 ميكروليتر من الخرز تنظيف لكل عينة وماصة لخلط.
ثم إضافة 350 ميكرولترات من الايزوبروبانول، مزيج العينة واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في حين هزاز. بعد الحضانة، وسحب تدور لوحة ومغنطة لمدة دقيقتين. تجاهل عظمى وغسل الخرز مع 950 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية.
جفف العينة لمدة ثلاث دقائق، ثم ازيل كل السائل المتبقي في الجزء السفلي من البئر. إزالة لوحة من موقف المغناطيسي. وإعادة تعليق الخرز في 13 ميكرولتررس من العازلة resuspension.
احتضان لوحة لمدة دقيقتين، ثم نقله مرة أخرى إلى موقف المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق. نقل 12 ميكرولترات من المابير إلى أنبوب نظيف وتخزينه بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية أو على المدى الطويل في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. تم حصاد الأجنة في E7.5 و E8.5 و E9.5.
و (سوميت) قام بحل الفواصل الزمنية لست ساعات وعندما استُخدم تحليل المكونات المبدئية لتجميع العينات استناداً إلى التشابه، تبين أن العينات تتجمع حسب العمر. تم تسمية خلايا القمم العصبية المهاجرة والخلايا التي تسمى E8.5 مع Wnt1-Cre و E9.5 مع Sox10-Cre.
وتؤكد مقارنة بين سائقي CRE أنهما تميز مجموعات مختلفة في أجنة الماوس المبكرة. تم تحديد كمية الحمض النووي الريبي مع مقياس الطيفي والكهرباء الشعرية. في حين أن تتبع الطيفي كشف أن الجيش الملكي النيبالي لا يحتوي على البروتينات الملوثة وتركيز الخلايا العالية، فإنه لم يكن حساسا بما فيه الكفاية للكشف عن التغيرات في تركيز الحمض النووي الريبي مع التقدم في السن.
يمكن استخدام أثر الكهرباء الشعرية لتقدير تركيز وحجم شظايا الحمض النووي الريبي. القمم في 2، 000 و 5، 100 النيوكليوتيدات هي 18S و 28S رنا الريبوسوم، على التوالي. بينما يقع المنطقة صغيرة [رنا] في حوالي 150 [نوكليوتيد].
يمكن استخدام استخراج جل لعزل المكتبات الصغيرة تسلسل RNA بعيدا عن التمهيديات محول. قبل الختان، وهناك العديد من أحجام المنتجات الموجودة في كل عينة. آثار الكهرباء الشعرية قبل وبعد تحديد حجم تظهر التحسن في نقاء 150 منتج مكتبة زوج قاعدة بعد تنقية هلام.
لقد صممنا هذا البروتوكول لتقسيم الإعدادية RNA من عينة واحدة في كل من مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة ومكتبات تسلسل مرنا بالجملة. وسيتناول ذلك المسائل التي تحيط ليس فقط بتعبير ميكرورنا، بل أيضاً عن الأهداف التي يمكن تنظيمها من قبل الـ microRNAs المعبّر عنها. وقد مكنتنا هذه التقنية من الحصول على رؤية شاملة لأكثر الRNAs التعبير عنها وتنظيم أهدافها في خلايا القمة العصبية القحفية بين التزجيج وإغلاق الأنبوب العصبي.
