Questo protocollo mira a semplificare la preparazione di piccole librerie di sequenziamento dell'RNA a basso input dai primi embrioni per profilare accuratamente i microRNA che regolano lo sviluppo embrionale. Il vantaggio di questa tecnica è che evita il pooling di campioni a basso input e può essere facilmente applicato sia a celle non ordinate che ordinate. Dimostriamo anche un'attenta stadiazione dell'embrione per evitare varianti tra repliche.
Questo metodo può essere applicato a studi temporali, genetici e di sviluppo o ad altre applicazioni in cui le concentrazioni di RNA in ingresso sono basse. In futuro, questo metodo potrebbe potenzialmente essere utilizzato per diagnosticare disturbi dello sviluppo in cui i microRNA sono disregolamentati. La parte tecnicamente più impegnativa di questo protocollo è la dissezione degli embrioni.
Perché ogni embrione deve essere sezionato, stadio, immagine e quindi dissociato rapidamente per garantire la vitalità cellulare. Per sezionare gli embrioni, sciacquare l'utero di un topo femmina incinta con PBS e posizionare in un piatto sterile di plastica di 10 centimetri. Utilizzare forbici a microdisezione per separare la regione contenente decidua e staccare il muscolo uterino per esporre tutta la decidua.
Per sezionare gli embrioni, sciacquare l'utero di un topo femmina incinta con PBS e posizionare in un piatto sterile di plastica di 10 centimetri. Utilizzare forbici a microdisezione per separare la regione contenente la decidua. Spostare tutti gli embrioni in un nuovo piatto con PBS pulito e scattare un'immagine dell'intera lettiera.
Quindi immagini ogni embrione individualmente e conta il numero di somiti, mantenendo costante l'ingrandimento e l'esposizione tra gli esperimenti. Per gli embrioni più vecchi di E8.0, decapitare appena sopra il placode otico e trasferire la testa in un pozzo pulito di una piastra da 48 po '. Aggiungere 250 microlitri di papaina al pozzo e pipettare delicatamente su e giù.
Utilizzare il microscopio per verificare la presenza di grumi e continuare a pipeggiare su e giù fino a ottenere una singola sospensione cellulare. Quindi aggiungere 250 microlitri di FBS alle celle e filtrare 500 microlitri della sospensione attraverso un filtro a rete in nylon da 35 micrometri. Spostare il filtrato su un nuovo tubo da 1,5 millilitri e farlo girare verso il basso a 200 x g per cinque minuti.
Trasferire il supernatante su un nuovo tubo e rimescolare il pellet cellulare in 300 microlitri di PBS con BSA. Quando si è pronti a ordinare di nuovo le celle attraverso un tubo del tappo del filtro e aggiungere DAPI per macchiare le celle vive. Utilizzare uno smistatore di celle con un ugello di 70 micrometri per ordinare ogni campione in 500 microlitri di soluzione di lisi di estrazione dell'RNA, quindi mescolare e conservare il campione a -80 gradi Celsius.
Aggiungere cinque microlitri di colorante di carico 6X a ciascun campione e mescolare mediante pipettazione. Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide 6%TBE a partire da quest'ultimo nel primo pozzo e lasciando una corsia tra ogni campione. Far funzionare il gel a 150 volt per 30-40 minuti in un buffer di funzionamento TBE 0,5X.
Quando il gel ha finito di funzionare, rimuoverlo con cura dalle lastre di vetro e posizionarlo nel vassoio dalla sua confezione originale, notando l'orientamento. Rimuovere il buffer di corsa e macchiare il gel per 15 minuti. E poi immaginilo su un illuminatore trans UV.
Identificare la banda a 150 coppie di basi e utilizzare una lama di rasoio pulita per asportarla. Assicurarsi di evitare il prodotto dimero dell'adattatore a 130 coppie di basi. Mettere le fette di gel in tubi di microcentrifugo e farle girare verso il basso alla velocità massima per 30 secondi.
Quindi, utilizzare una punta P200 per schiacciare la fetta di gel nei bit più piccoli possibili ed espellere la punta nel tubo. Aggiungere 300 microlitri di tampone di eluizione a ciascun tubo, lavando i pezzi di gel dal lato. Riattaccare la punta della pipetta e lavarla via prima di rimuoverla dal tubo.
Incubare i campioni durante la notte a 25 gradi Celsius con 1.000 giri/min tremanti. Il giorno successivo, spinli verso il basso alla massima velocità per 10 minuti e trasferisci il supernatante su una piastra da 96 pozzi senza RNasi. Aggiungere 50 microlitri di perline di pulizia a ciascun campione e pipetta da mescolare.
Quindi aggiungere 350 microlitri di isopropanolo, mescolare il campione e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti durante il dondolo. Dopo l'incubazione, tirare girare la piastra e magnetizzarla per due minuti. Scartare il supernatante e lavare le perline con 950 microlitri di 80%etanolo per 30 secondi.
Asciugare il campione per tre minuti, quindi rimuovere tutto il liquido residuo nella parte inferiore del pozzo. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. E rimospendare le perline in 13 microlitri del tampone di resuspensione.
Incubare la piastra per due minuti, quindi trasferirla di nuovo sul supporto magnetico per tre minuti. Trasferire 12 microlitri del supernatante in un tubo pulito e conservarlo durante la notte a quattro gradi Celsius o a lungo termine a -20 gradi Celsius. Sono stati raccolti embrioni a E7.5, E8.5 ed E9.5.
E somite messo in scena per risolvere gli intervalli di tempo di sei ore. Quando l'analisi dei componenti principali è stata utilizzata per raggruppare campioni in base alla somiglianza, è stato scoperto che i campioni si raggruppano per età. Le cellule della cresta neurale premigratoria e migratrice sono state etichettate come E8.5 con Wnt1-Cre e un E9.5 con Sox10-Cre.
Un confronto tra i due driver CRE conferma che segnano popolazioni diverse nei primi embrioni di topo. L'RNA è stato quantificato con uno spettrofotometro e un'elettroforesi capillare. Mentre la traccia dello spettrofotometro ha rivelato che l'RNA non contiene proteine contaminanti e un'alta concentrazione cellulare, non era abbastanza sensibile da rilevare cambiamenti nella concentrazione di RNA con l'età.
La traccia di elettroforesi capillare può essere utilizzata per stimare la concentrazione e le dimensioni dei frammenti di RNA. I picchi a 2.000 e 5,100 nucleotidi sono rispettivamente 18S e 28S di RNA ribosomiale. Mentre la piccola regione dell'RNA si trova a circa 150 nucleotidi.
L'estrazione del gel può essere utilizzata per isolare le piccole librerie di sequenziamento dell'RNA lontano dai primer dell'adattatore. Prima dell'escissione, in ogni campione sono presenti una moltitudine di dimensioni del prodotto. Le tracce di elettroforesi capillare prima e dopo la selezione delle dimensioni mostrano il miglioramento della purezza del prodotto libreria a 150 coppie di basi dopo la purificazione del gel.
Abbiamo progettato questo protocollo per dividere una preparazione dell'RNA da un singolo campione sia in piccole librerie di sequenziamento dell'RNA che in librerie di sequenziamento dell'mRNA di massa. Ciò affronterà questioni che circondano non solo l'espressione del microRNA, ma anche quali obiettivi di mRNA possono essere regolati dai microRNA espressi. Questa tecnica ci ha permesso di ottenere una visione completa dei microRNA più espressi e la regolazione dei loro obiettivi nelle cellule cranici della cresta neurale tra gastrulazione e chiusura del tubo neurale.
