Este protocolo tiene como objetivo simplificar la preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN pequeño y de baja entrada de los primeros embriones para perfilar con precisión los microARN que regulan el desarrollo embrionario. La ventaja de esta técnica es que evita la agrupación de muestras de entrada baja y se puede aplicar fácilmente a celdas no ordenadas y ordenadas. También demostramos una cuidadosa puesta en escena de embriones para evitar variantes entre réplicas.
Este método se puede aplicar a estudios temporales, genéticos y de desarrollo u otras aplicaciones donde las concentraciones de ARN de entrada son bajas. En el futuro, este método podría utilizarse potencialmente para diagnosticar trastornos del desarrollo en los que se desregulan los microRN. La parte técnicamente más difícil de este protocolo es la disección embrionaria.
Debido a que cada embrión debe ser diseccionado, etapa, imagen, y luego disociado rápidamente para asegurar la viabilidad celular. Para diseccionar los embriones, enjuague el útero de una hembra embarazada con PBS y colóquelo en un plato de plástico estéril de 10 centímetros. Utilice tijeras de microdisección para separar la región que contiene decidua y despegar el músculo uterino para exponer toda la decidua.
Para diseccionar los embriones, enjuague el útero de una hembra embarazada con PBS y colóquelo en un plato de plástico estéril de 10 centímetros. Utilice tijeras de microdisección para separar la región que contiene decidua. Mueva todos los embriones a un nuevo plato con PBS limpio y tome una imagen de toda la camada.
A continuación, imagine cada embrión individualmente y cuente el número de somites, manteniendo constante la ampliación y la exposición entre experimentos. Para embriones mayores que E8.0, decapitar justo encima del placode otico y transferir la cabeza a un pozo limpio de una placa de 48 pozos. Añadir 250 microlitros de papaína al pozo y pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente.
Utilice el microscopio para comprobar si hay grumos y continuar pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que se logre una sola suspensión celular. Luego agregue 250 microlitros de FBS a las células y filtre 500 microlitros de la suspensión a través de un filtro de malla de nylon de 35 micrómetros. Mueva el filtrado a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y gírtelo a 200 x g durante cinco minutos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y resuspendir el pellet celular en 300 microlitros de PBS con BSA. Cuando esté listo para ordenar las células de nuevo a través de un tubo de tapa de filtro y agregue DAPI para manchar las células vivas. Utilice un clasificador celular con una boquilla de 70 micrómetros para clasificar cada muestra en 500 microlitros de solución de lysis de extracción de ARN, luego mezcle y almacene la muestra a 80 grados Celsius negativos.
Agregue cinco microlitros de tinte de carga 6X a cada muestra y mezcle por pipeteo. Cargue las muestras en un gel de poliacrilamida 6%TBE comenzando con este último en el primer pozo y dejando un carril entre cada muestra. Ejecute el gel a 150 voltios durante 30 a 40 minutos en el búfer de funcionamiento de 0,5X TBE.
Cuando el gel haya terminado de funcionar, retírelo cuidadosamente de las placas de vidrio y colóquelo en la bandeja de su embalaje original, observando la orientación. Retire el tampón de funcionamiento y manche el gel durante 15 minutos. Y luego imagen en un iluminador trans UV.
Identifique la banda en 150 pares base y use una cuchilla de afeitar limpia para extirparlo. Asegúrese de evitar el producto de dimer adaptador en 130 pares base. Coloque las rodajas de gel en los tubos de microcentrífuga y gírtelos hacia abajo a la velocidad máxima durante 30 segundos.
A continuación, utilice una punta P200 para triturar la rebanada de gel en los bits más pequeños posibles y expulsar la punta en el tubo. Añadir 300 microlitros de tampón de elución a cada tubo, lavando las brocas de gel desde el lado. Vuelva a colocar la punta de la pipeta y lávela antes de retirarla del tubo.
Incubar las muestras durante la noche a 25 grados centígrados con 1.000 RPM agitando. Al día siguiente, gírelos hacia abajo a la velocidad máxima durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a una placa de 96 pozos sin RNase. Agregue 50 microlitros de cuentas de limpieza a cada muestra y pipeta para mezclar.
A continuación, añadir 350 microlitros de isopropanol, mezclar la muestra e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras se balancea. Después de la incubación, tire de girar la placa y magnetizarla durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y lave las perlas con 950 microlitros de 80% etanol durante 30 segundos.
Seque la muestra durante tres minutos y, a continuación, retire todo el líquido residual en la parte inferior del pozo. Retire la placa del soporte magnético. Y resuspender las cuentas en 13 microlitros del buffer de resuspensión.
Incubar la placa durante dos minutos, luego transferirla de vuelta al soporte magnético durante tres minutos. Transfiera 12 microlitros del sobrenadante a un tubo limpio y guárdelo durante la noche a cuatro grados centígrados o a largo plazo a 20 grados Celsius negativos. Se cosecharon embriones en E7.5, E8.5 y E9.5.
Y somite escenificada para resolver los intervalos de tiempo de seis horas. Cuando se utilizó el análisis de componentes de principios para agrupar muestras en función de la similitud, se encontró que las muestras se agrupan por edad. Las células de cresta neural premigratorias y migratorias fueron etiquetadas como E8.5 con Wnt1-Cre y un E9.5 con Sox10-Cre.
Una comparación de los dos conductores de CRE confirma que marcan diferentes poblaciones en embriones de ratón tempranos. El ARN se cuantificó con un espectrofotómetro y una electroforesis capilar. Mientras que el rastro del espectrofotómetro reveló que el ARN no contiene proteínas contaminantes y una alta concentración celular, no era lo suficientemente sensible como para detectar cambios en la concentración de ARN con la edad.
El rastro de electroforesis capilar se puede utilizar para estimar la concentración y el tamaño de los fragmentos de ARN. Los picos de 2.000 y 5, 100 nucleótidos son ARN ribosomal 18S y 28S, respectivamente. Mientras que la pequeña región de ARN se encuentra en unos 150 nucleótidos.
La extracción de gel se puede utilizar para aislar las pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN lejos de las imprimaciones del adaptador. Antes de la escisión, una multitud de tamaños de producto están presentes en cada muestra. Los rastros de electroforesis capilar antes y después de la selección de tamaño muestran la mejora en la pureza del producto de la biblioteca de 150 pares base después de la purificación del gel.
Hemos diseñado este protocolo para dividir una preparación de ARN de una sola muestra en bibliotecas de secuenciación de ARN pequeñas y bibliotecas de secuenciación de ARNm a granel. Esto abordará las preguntas que rodean no sólo la expresión del microARN, sino también qué objetivos de ARNm pueden estar regulados por los microARN expresados. Esta técnica nos permitió obtener una visión completa de los microRNas más expresados y la regulación de sus objetivos en células de cresta neural craneal entre la gastrulación y el cierre del tubo neural.
