Este protocolo visa simplificar a preparação de bibliotecas de sequenciamento de RNA de baixa entrada e pequenas bibliotecas de sequenciamento de RNA a partir de embriões primitivos para traçar o perfil preciso das microRNAs que regulam o desenvolvimento embrionário. A vantagem desta técnica é que evita o agrupamento de amostras de baixa entrada e pode ser facilmente aplicada em células não classificadas e classificadas. Também demonstramos um embrião cuidadoso para evitar variantes entre as réplicas.
Este método pode ser aplicado a estudos temporais, genéticos e de desenvolvimento ou outras aplicações onde as concentrações de RNA de entrada são baixas. No futuro, esse método poderia potencialmente ser usado para diagnosticar distúrbios do desenvolvimento nos quais as microRNAs são desreguladas. A parte mais tecnicamente desafiadora deste protocolo é a dissecação do embrião.
Porque cada embrião deve ser dissecado, estágio, imagem, e então dissociado rapidamente para garantir a viabilidade celular. Para dissecar os embriões, enxágüe o útero de uma fêmea grávida com PBS e coloque-o em um prato plástico estéril de 10 centímetros. Use uma tesoura de microdisseção para separar a região contendo a decidua e descascar o músculo uterino para expor toda a decisão.
Para dissecar os embriões, enxágüe o útero de uma fêmea grávida com PBS e coloque-o em um prato plástico estéril de 10 centímetros. Use uma tesoura de microdisseção para separar a região contendo decidua. Mova todos os embriões para um novo prato com PBS limpo e tire uma imagem de toda a ninhada.
Em seguida, imagem cada embrião individualmente, e contar o número de somites, mantendo a ampliação e exposição constante entre experimentos. Para embriões mais velhos que e8.0, decapitar um pouco acima do código óptico e transferir a cabeça para um poço limpo de uma placa de 48 poços. Adicione 250 microliters de papain ao poço e pipeta para cima e para baixo suavemente.
Use o microscópio para verificar se há aglomerados e continue a tubulação para cima e para baixo até que uma única suspensão celular seja alcançada. Em seguida, adicione 250 microliters de FBS às células e filtre 500 microliters da suspensão através de um filtro de malha de nylon de 35 micrômetros. Mova o filtrado para um novo tubo de 1,5 mililitro e gire-o a 200 x g por cinco minutos.
Transfira o supernatante para um novo tubo, e resuspenja a pelota celular em 300 microliters de PBS com BSA. Quando estiver pronto para classificar as células novamente através de um tubo de tampa de filtro e adicionar DAPI para manchar células vivas. Use um classificador de células com um bocal de 70 micrômetros para classificar cada amostra em 500 microliters da solução de extração de RNA, em seguida, misturar e armazenar a amostra a 80 graus Celsius negativos.
Adicione cinco microliters de corante de carregamento 6X a cada amostra e misture por pipetação. Carregue as amostras em um gel de poliacrilamida de 6% TBE começando com o último no primeiro poço e deixando uma faixa entre cada amostra. Execute o gel a 150 volts por 30 a 40 minutos em 0,5X TBE em execução tampão.
Quando o gel terminar de funcionar, remova-o cuidadosamente das placas de vidro e coloque-o na bandeja de sua embalagem original, observando a orientação. Remova o tampão de corrida e manche o gel por 15 minutos. E então imagem-lo em um iluminador trans UV.
Identifique a banda em 150 pares de base e use uma lâmina de barbear limpa para extirá-la. Certificando-se de evitar o produto de adaptador dimer em 130 pares de base. Coloque as fatias de gel em tubos de microcentrifuuagem e gire-as na velocidade máxima por 30 segundos.
Em seguida, use uma ponta P200 para esmagar a fatia de gel nos menores pedaços possíveis e ejete a ponta no tubo. Adicione 300 microliters de tampão de elução a cada tubo, lavando os pedaços de gel do lado. Recoloque a ponta da pipeta e lave-a antes de removê-la do tubo.
Incubar as amostras durante a noite a 25 graus Celsius com 1.000 RPM tremendo. No dia seguinte, gire-os em velocidade máxima por 10 minutos e transfira o supernante para uma placa de 96 poços sem RNase. Adicione 50 microliters de contas de limpeza a cada amostra e pipeta para misturar.
Em seguida, adicione 350 microliters de isopropanol, misture a amostra e incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos enquanto balança. Após a incubação, puxe a placa e magnetize-a por dois minutos. Descarte o supernascer e lave as contas com 950 microliters de 80% de etanol por 30 segundos.
Seque a amostra por três minutos e remova todo o líquido residual na parte inferior do poço. Remova a placa do suporte magnético. E resuspense as contas em 13 microliters do buffer de ressuspensão.
Incubar a placa por dois minutos e depois transferi-la de volta para o suporte magnético por três minutos. Transfira 12 microlitadores do supernante para um tubo limpo e armazene-o durante a noite a quatro graus Celsius ou a longo prazo a 20 graus Celsius negativos. Foram colhidos embriões em E7.5, E8.5 e E9.5.
E somite encenado para resolver os intervalos de tempo de seis horas. Quando a análise dos componentes de princípio foi utilizada para agrupar amostras com base na similaridade, verificou-se que as amostras agrupam por idade. Células de crista neural pré-migratória e migratória foram rotuladas como E8.5 com Wnt1-Cre e um E9.5 com Sox10-Cre.
Uma comparação dos dois drivers cre confirma que eles marcam populações diferentes em embriões de camundongos primitivos. O RNA foi quantificado com um espectotômetro e eletroforese capilar. Embora o traço espectrômetro revelou que o RNA não contém proteínas contaminantes e uma alta concentração celular, não foi sensível o suficiente para detectar alterações na concentração de RNA com a idade.
O traço de eletroforese capilar pode ser usado para estimar concentração e tamanho dos fragmentos de RNA. Picos em 2.000 e 5.100 nucleotídeos são 18S e 28S ribossômicos RNA, respectivamente. Enquanto a pequena região de RNA está localizada em cerca de 150 nucleotídeos.
A extração de gel pode ser usada para isolar as pequenas bibliotecas de sequenciamento de RNA longe dos primers do adaptador. Antes da excisão, uma infinidade de tamanhos de produtos estão presentes em cada amostra. Traços de eletroforese capilar antes e depois da seleção de tamanho mostram a melhora na pureza do produto da biblioteca do par base após a purificação do gel.
Projetamos este protocolo para dividir uma preparação de RNA de uma única amostra em bibliotecas de sequenciamento de RNA pequenas e bibliotecas de sequenciamento de mRNA em massa. Isso abordará questões que envolvem não apenas a expressão de microRNA, mas também quais metas de mRNA podem ser reguladas pelas microRNAs expressas. Esta técnica nos permitiu obter uma visão abrangente das microRNAs mais altamente expressas e a regulação de seus alvos em células de crista neural craniana entre gastrulação e fechamento de tubos neurais.
