Ce protocole vise à simplifier la préparation de petites bibliothèques de séquençage de l’ARN à faible apport à partir d’embryons précoces afin de profiler avec précision les microARN qui régulent le développement embryonnaire. L’avantage de cette technique est qu’elle évite la mise en commun d’échantillons à faible entrée et peut facilement être appliquée à la fois aux cellules non triées et triées. Nous démontrons également la mise en scène soignante d’embryon pour éviter des variantes entre des répétitions.
Cette méthode peut être appliquée à des études temporelles, génétiques et développementales ou à d’autres applications où les concentrations d’ARN d’entrée sont faibles. À l’avenir, cette méthode pourrait potentiellement être utilisée pour diagnostiquer les troubles du développement dans lesquels les microARN sont dysregulated. La partie la plus difficile techniquement de ce protocole est la dissection embryonnaire.
Parce que chaque embryon doit être disséqué, stade, image, puis dissocié rapidement pour assurer la viabilité cellulaire. Pour disséquer les embryons, rincer l’utérus d’une souris femelle enceinte avec du PBS et le placer dans un plat stérile en plastique de 10 centimètres. Utilisez des ciseaux de microdissection pour séparer la decidua contenant la région et décoller le muscle utérin pour exposer tous les decidua.
Pour disséquer les embryons, rincer l’utérus d’une souris femelle enceinte avec du PBS et le placer dans un plat stérile en plastique de 10 centimètres. Utilisez des ciseaux de microdissection pour séparer la région contenant du decidua. Déplacez tous les embryons dans un nouveau plat avec du PBS propre et prenez une image de toute la litière.
Puis l’image de chaque embryon individuellement, et compter le nombre de somites, en gardant le grossissement et l’exposition constante entre les expériences. Pour les embryons de plus de E8.0, décapiter juste au-dessus du placode otic et transférer la tête dans un puits propre d’une plaque de 48 puits. Ajouter 250 microlitres de papain au puits et pipette de haut en bas doucement.
Utilisez le microscope pour vérifier s’il y a des touffes et continuer à faire des tuyaux de haut en bas jusqu’à ce qu’une seule suspension cellulaire soit atteinte. Ajoutez ensuite 250 microlitres de FBS aux cellules et filtrez 500 microlitres de la suspension à l’aide d’un filtre à mailles en nylon de 35 micromètres. Déplacez le filtrate dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et faites-le tourner à 200 x g pendant cinq minutes.
Transférez le supernatant dans un nouveau tube et réutilisez la pastille cellulaire dans 300 microlitres de PBS avec BSA. Lorsqu’il est prêt à trier filtrer les cellules à nouveau à travers un tube de bouchon de filtre et ajouter DAPI pour tacher les cellules vivantes. Utilisez un trieur cellulaire avec une buse de 70 micromètres pour trier chaque échantillon en 500 microlitres de solution de lyse d’extraction d’ARN, puis mélanger et stocker l’échantillon à 80 degrés Celsius négatifs.
Ajouter cinq microlitres de colorant de chargement 6X à chaque échantillon et mélanger au pipetage. Chargez les échantillons sur un gel polyacrylamide TBE de 6 %, en commençant par ce dernier dans le premier puits et en laissant une voie entre chaque échantillon. Faire fonctionner le gel à 150 volts pendant 30 à 40 minutes en tampon de fonctionnement 0,5 X TBE.
Lorsque le gel a fini de fonctionner, retirez-le soigneusement des plaques de verre et placez-le dans le plateau de son emballage d’origine, en notant l’orientation. Retirer le tampon en cours d’exécution et tacher le gel pendant 15 minutes. Et puis l’image sur un illuminateur trans UV.
Identifiez la bande à 150 paires de base et utilisez une lame de rasoir propre pour l’exciser. S’assurer d’éviter le produit dimer adaptateur à 130 paires de base. Mettez les tranches de gel dans des tubes de microcentrifugeuse et faites-les tourner vers le bas à la vitesse maximale pendant 30 secondes.
Ensuite, utilisez une pointe P200 pour écraser la tranche de gel dans les plus petits morceaux possibles et éjecter la pointe dans le tube. Ajouter 300 microlitres de tampon d’élitution à chaque tube, en lavant les morceaux de gel sur le côté. Rattacher la pointe de la pipette et la laver avant de l’enlever du tube.
Incuber les échantillons pendant la nuit à 25 degrés Celsius avec 1000 RPM secouant. Le lendemain, faites-les tourner vers le bas à la vitesse maximale pendant 10 minutes et transférez le supernatant à une plaque 96-puits sans RNase. Ajouter 50 microlitres de perles de nettoyage à chaque échantillon et pipette à mélanger.
Ajouter ensuite 350 microlitres d’isopropanol, mélanger l’échantillon et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes pendant le basculement. Après l’incubation, tirez sur la plaque et magnétisez-la pendant deux minutes. Jeter le supernatant et laver les perles avec 950 microlitres de 80% d’éthanol pendant 30 secondes.
Sécher l’échantillon pendant trois minutes, puis retirer tout le liquide résiduel au fond du puits. Retirez la plaque du support magnétique. Et resuspendez les perles dans 13 microlitres du tampon de resuspension.
Incuber la plaque pendant deux minutes, puis la transférer sur le support magnétique pendant trois minutes. Transférez 12 microlitres du supernatant dans un tube propre et rangez-le toute la nuit à quatre degrés Celsius ou à long terme à 20 degrés Celsius négatifs. Des embryons à E7.5, E8.5, et E9.5 ont été récoltés.
Et somite mis en scène pour résoudre les intervalles de temps de six heures. Lorsque l’analyse des composants principaux a été utilisée pour regrouper des échantillons en fonction de la similitude, il a été constaté que les échantillons se regroupent selon l’âge. Des cellules prémigratoires et migratoires de crête neurale ont été étiquetées cela E8.5 avec Wnt1-Cre et un E9.5 avec des Sox10-Cre.
Une comparaison des deux conducteurs de la CRE confirme qu’ils marquent des populations différentes dans les embryons de souris précoces. L’ARN a été quantifié avec un spectrophotomètre et un électrophoresis capillaire. Bien que la trace du spectrophotomètre ait révélé que l’ARN ne contient aucune protéine contaminante et une concentration élevée de cellules, il n’était pas assez sensible pour détecter les changements dans la concentration d’ARN avec l’âge.
La trace d’électrophoresis capillaire peut être utilisée pour estimer la concentration et la taille des fragments d’ARN. Les pics à 2000 et 5 100 nucléotides sont 18S et 28S arn ribosomal, respectivement. Alors que la petite région de l’ARN est située à environ 150 nucléotides.
L’extraction du gel peut être utilisée pour isoler les petites bibliothèques de séquençage de l’ARN loin des amorces de l’adaptateur. Avant l’excision, une multitude de tailles de produits sont présentes dans chaque échantillon. Les traces d’électrophorèse capillaire avant et après la sélection des tailles montrent l’amélioration de la pureté du produit de bibliothèque de 150 paires de base après purification du gel.
Nous avons conçu ce protocole pour diviser une préparation d’ARN à partir d’un seul échantillon en petites bibliothèques de séquençage de l’ARN et en vrac bibliothèques de séquençage de l’ARNm. Cela permettra de répondre aux questions entourant non seulement l’expression microARN, mais aussi les cibles d’ARNm qui peuvent être réglementées par les microARN exprimés. Cette technique nous a permis d’obtenir une vue complète des microARN les plus exprimés et la régulation de leurs cibles dans les cellules de crête neurale crânienne entre la gastrulation et la fermeture du tube neural.
