Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Vorbereitung von kleinen RNA-Sequenzierungsbibliotheken mit niedrigem Input aus frühen Embryonen zu vereinfachen, um die microRNAs, die die embryonale Entwicklung regulieren, genau zu profilieren. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Pooling von Proben mit niedriger Eingabe vermeidet und leicht auf nicht sortierte und sortierte Zellen angewendet werden kann. Wir zeigen auch sorgfältige Embryo-Inszenierung, um Varianten zwischen Replikationen zu vermeiden.
Diese Methode kann auf zeitliche, genetische und Entwicklungsstudien oder andere Anwendungen angewendet werden, bei denen die Eingangs-RNA-Konzentrationen niedrig sind. In Zukunft könnte diese Methode möglicherweise zur Diagnose von Entwicklungsstörungen verwendet werden, bei denen microRNAs dysreguliert sind. Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Protokolls ist die Embryosektion.
Denn jeder Embryo muss seziert, inszeniert, abgebildet und dann schnell getrennt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten. Um die Embryonen zu sezieren, spülen Sie die Gebärmutter einer schwangeren weiblichen Maus mit PBS ab und legen Sie sie in eine sterile 10-Zentimeter-Schale aus Kunststoff. Verwenden Sie Mikrodissektionschere, um die Dezidua enthaltende Region zu trennen und schälen Sie den Gebärmuttermuskel, um alle Decidua auszusetzen.
Um die Embryonen zu sezieren, spülen Sie die Gebärmutter einer schwangeren weiblichen Maus mit PBS ab und legen Sie sie in eine sterile 10-Zentimeter-Schale aus Kunststoff. Verwenden Sie Mikrodissektionsscheren, um die dezidua enthaltende Region zu trennen. Bewegen Sie alle Embryonen in eine neue Schale mit sauberem PBS und nehmen Sie ein Bild des gesamten Wurfs.
Dann bilde jeden Embryo einzeln ab und zähle die Anzahl der Mengen, wobei die Vergrößerung und Belichtung zwischen den Experimenten konstant bleiben. Bei Embryonen, die älter als E8.0 sind, enthaupten Sie knapp über dem otischen Placode und übertragen Sie den Kopf auf einen sauberen Brunnen einer 48-Well-Platte. Fügen Sie 250 Mikroliter Papain in den Brunnen und Pipette sanft auf und ab.
Verwenden Sie das Mikroskop, um auf Klumpen zu überprüfen und weiter nach oben und unten zu pfeifen, bis eine Einzelzellsuspension erreicht ist. Dann 250 Mikroliter FBS in die Zellen geben und 500 Mikroliter der Suspension durch einen 35 Mikrometer Nylon-Netzfilter filtern. Bewegen Sie das Filtrat in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr und drehen Sie es fünf Minuten lang bei 200 x g nach unten.
Übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr und setzen Sie das Zellpellet in 300 Mikroliter PBS mit BSA wieder auf. Wenn Sie bereit sind, die Zellen erneut durch ein Filterkappenrohr zu filtern und DAPI hinzuzufügen, um lebende Zellen zu färben. Verwenden Sie einen Zellsortierer mit einer 70-Mikrometer-Düse, um jede Probe in 500 Mikroliter RNA-Extraktionslyselösung zu sortieren, dann mischen und speichern Sie die Probe bei negativen 80 Grad Celsius.
Fügen Sie fünf Mikroliter 6X Ladefarbstoff zu jeder Probe und mischen durch Pipettieren. Die Proben auf ein 6%TBE Polyacrylamid-Gel legen, beginnend mit letzterem im ersten Brunnen und eine Spur zwischen jeder Probe. Führen Sie das Gel bei 150 Volt für 30 bis 40 Minuten in 0.5X TBE Laufpuffer.
Wenn das Gel fertig ist, entfernen Sie es vorsichtig von den Glasplatten und legen Sie es in das Tablett aus der Originalverpackung, unter Notierung der Ausrichtung. Entfernen Sie den Laufpuffer und färben Sie das Gel für 15 Minuten. Und dann bilde es auf einem UV-Trans-Beleuchtungsgerät.
Identifizieren Sie das Band bei 150 Basispaaren und verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um es zu verbrauchen. Achten Sie darauf, das Adapter-Dimer-Produkt bei 130 Basispaaren zu vermeiden. Die Gelscheiben in Mikrozentrifugenröhrchen geben und 30 Sekunden lang mit der maximalen Geschwindigkeit nach unten drehen.
Als nächstes verwenden Sie eine P200-Spitze, um die Gelscheibe in die kleinsten Teile zu zerkleinern und die Spitze in das Rohr auszuwerfen. Fügen Sie 300 Mikroliter Elutionspuffer in jedes Rohr, waschen Sie die Gel-Bits von der Seite. Die Pipettenspitze wieder anbringen und abwaschen, bevor Sie sie aus dem Rohr entfernen.
Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 25 Grad Celsius mit 1.000 RPM Schütteln. Am nächsten Tag drehen Sie sie mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten nach unten und übertragen Sie den Überstand auf eine RNase-freie 96-Well-Platte. Fügen Sie 50 Mikroliter Reinigungsperlen zu jeder Probe und Pipette zu mischen.
Dann 350 Mikroliter Isopropanol hinzufügen, die Probe mischen und die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten beim Schaukeln brüten. Nach der Inkubation die Platte ziehen und zwei Minuten magnetisieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Perlen 30 Sekunden lang mit 950 Mikrolitern 80% Ethanol.
Trocknen Sie die Probe für drei Minuten, dann entfernen Sie alle Restflüssigkeit an der Unterseite des Brunnens. Entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen Ständer. Und die Perlen in 13 Mikroliter des Resuspensionspuffers wieder aussetzen.
Inkubieren Sie die Platte für zwei Minuten, dann übertragen Sie sie für drei Minuten wieder auf den magnetischen Ständer. 12 Mikroliter des Überstandes in ein sauberes Rohr geben und über Nacht bei vier Grad Celsius oder langfristig bei minus 20 Grad Celsius lagern. Embryonen bei E7.5, E8.5 und E9.5 wurden geerntet.
Und so inszeniert, um die sechs Stunden Zeitintervalle zu lösen. Wenn die Hauptkomponentenanalyse verwendet wurde, um Stichproben basierend auf Ähnlichkeit zu gruppieren, wurde festgestellt, dass Proben nach Alter gruppiert werden. Vorwandernde und wandernde neurale Kammzellen wurden als E8.5 mit Wnt1-Cre und eine E9.5 mit Sox10-Cre bezeichnet.
Ein Vergleich der beiden CRE-Treiber bestätigt, dass sie unterschiedliche Populationen in frühen Mausembryonen markieren. Die RNA wurde mit einem Spektralphotometer und einer kapillaren Elektrophorese quantifiziert. Während die Spektralphotometer-Spur zeigte, dass die RNA keine kontaminierenden Proteine und eine hohe Zellkonzentration enthält, war sie nicht empfindlich genug, um Veränderungen der RNA-Konzentration mit dem Alter zu erkennen.
Die Kapillarelektrophoresespur kann verwendet werden, um die Konzentration und Größe der RNA-Fragmente zu schätzen. Peaks bei 2,000 und 5, 100 Nukleotide sind 18S und 28S ribosomale RNA. Während sich die kleine RNA-Region bei etwa 150 Nukleotiden befindet.
Die Gelextraktion kann verwendet werden, um die kleinen RNA-Sequenzierungsbibliotheken von den Adapterprimern zu isolieren. Vor der Exzision sind in jeder Probe eine Vielzahl von Produktgrößen vorhanden. Kapillarelektrophoresespuren vor und nach der Größenauswahl zeigen die Verbesserung der Reinheit des 150 Base pair Bibliotheksprodukts nach der Gelreinigung.
Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um eine RNA-Vorbereitung von einer einzigen Probe in kleine RNA-Sequenzierungsbibliotheken und Massen-mRNA-Sequenzierungsbibliotheken aufzuteilen. Dabei werden nicht nur Fragen zur microRNA-Expression beantwortet, sondern auch, welche mRNA-Ziele durch die exprimierten microRNAs reguliert werden können. Diese Technik ermöglichte es uns, einen umfassenden Überblick über die am höchsten exprimierte mikroRNAs und die Regulierung ihrer Ziele in kranialen neuralen Kammzellen zwischen Gastrulation und Neuralrohrverschluss zu erhalten.
