このプロトコルは、初期胚からの低入力の小さなRNAシーケンシングライブラリの調製を簡素化し、胚発生を調節するマイクロRNAを正確にプロファイリングすることを目的としています。この手法の利点は、低入力サンプルのプーリングを回避し、並べ替えなしと並べ替えの両方のセルに簡単に適用できることです。我々はまた、反復間の変異体を避けるために慎重な胚ステージングを実証する。
この方法は、一時的、遺伝的、および発達的研究または入力RNA濃度が低い他のアプリケーションに適用することができます。将来的には、この方法は、マイクロRNAが調節不秩序である発達障害を診断するために使用される可能性があります。このプロトコルの最も技術的に困難な部分は、胚の解剖です。
各胚は解剖されなければならないので、ステージ、画像、そして細胞の生存率を確保するために迅速に解離する。胚を解剖するには、PBSで妊娠中の雌マウスの子宮をすすいで、無菌プラスチック10センチメートル皿に入れます。マイクロディションハサミを使用して、デシドゥア含有領域を分離し、子宮筋を剥がしてすべてのデシドゥアを露出させる。
胚を解剖するには、PBSで妊娠中の雌マウスの子宮をすすいで、無菌プラスチック10センチメートル皿に入れます。マイクロディションはさみを使用して、デシドゥアを含む領域を分離します。きれいなPBSで新しい皿にすべての胚を移動し、全体のごみの画像を撮ります。
次に、各胚を個別に画像化し、スマイトの数を数え、実験の間の拡大および暴露を一定に保つ。E8.0より古い胚の場合は、オティックプラコードのすぐ上に首を切り落とし、頭を48ウェルプレートのきれいな井戸に移します。井戸にパパイン250マイクロリットルを加え、ピペットを上下に軽く加えます。
顕微鏡を使用して塊をチェックし、単一の細胞懸濁液が達成されるまでピペットを上下に進め続けます。その後、FBSの250マイクロリットルをセルに加え、35マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターを介してサスペンションの500マイクロリットルをフィルターします。濾液を新しい1.5ミリリットルチューブに移動し、200 x gで5分間回転させます。
上清を新しいチューブに移し、細胞ペレットをBSAで300マイクロリットルのPBSで再懸濁する。フィルター キャップ チューブを通じて再度セルを並べ替える準備ができたら、DAPI を追加して生きたセルを染色します。70マイクロメートルノズルを備えたセルソーターを使用して、各サンプルを500マイクロリットルのRNA抽出溶解溶液に分類し、サンプルをマイナス80°Cで混合して保存します。
各サンプルに6X負荷染料を5マイクロリットル加え、ピペットで混合します。サンプルを6%TBEポリアクリルアミドゲルにロードし、最初のウェルで後者から始まり、各サンプルの間に1車線を残します。0.5X TBEランニングバッファで30〜40分間、150ボルトでゲルを実行します。
ゲルの動きが終わったら、慎重にガラス板から取り出し、向きに注意して、元のパッケージからトレイに入れます。ランニングバッファーを取り出し、ゲルを15分間染色します。そして、UVトランスイルミニューター上でそれを画像化します。
150塩基対でバンドを識別し、それを切除するためにきれいなカミソリの刃を使用しています。130 塩基対でアダプターダイマー製品を避けるようにしてください。ゲルスライスをマイクロ遠心チューブに入れ、最高速度で30秒間回転させます。
次に、P200 チップを使用してゲルスライスを可能な限り小さいビットにつぶし、チューブにチップを排出します。各チューブに300マイクロリットルの溶出バッファーを加えて、側面からゲルビットを洗浄する。ピペットチップを取り付け直し、チューブから取り外す前に洗い流してください。
1,000 RPMの揺れで摂氏25度で一晩サンプルをインキュベートします。翌日、最高速度で10分間スピンダウンし、上清をRNaseフリーの96ウェルプレートに移します。各サンプルとピペットに50マイクロリットルのクリーンアップビーズを加え、混合します。
その後、イソプロパノールの350マイクロリットルを追加し、サンプルを混合し、揺れながら10分間室温でプレートをインキュベートします。インキュベーション後、プレートを引っ張って2分間磁化します。上清を捨て、950マイクロリットルの80%エタノールでビーズを30秒間洗います。
サンプルを3分間乾燥させ、井戸底の残留液をすべて取り除きます。磁気スタンドからプレートを取り外します。そして、再懸濁液バッファーの13マイクロリットルにビーズを再懸濁します。
プレートを2分間インキュベートし、磁気スタンドに3分間戻します。清浄なチューブに上澄みの12マイクロリットルを移し、マイナス20°Cで摂氏4度または長期で一晩保存します。E7.5、E8.5、E9.5の胚を収穫した。
そして、6時間の時間間隔を解決するために上演されたスマイト。原理成分分析を用いて類似性に基づいてサンプルをグループ化したところ、サンプルが年齢別にクラスター化していることが分かった。前回遊びおよび回遊性神経堤細胞は、Wnt1-CreでE8.5、Sox10-Creを有するE9.5とラベル付けした。
2つのCREドライバーの比較は、彼らが初期のマウス胚で異なる集団をマークすることを確認します。分光光度計と毛細管電気泳動でRNAを定量した。分光光度計の痕跡から、RNAには汚染タンパク質がなく、高い細胞濃度が含まれていないことが明らかになったが、年齢とともにRNA濃度の変化を検出するのに十分な感度はなかった。
毛細管電気泳動のトレースは、RNA断片の濃度およびサイズを推定するために使用することができる。2,000及び5,5,100ヌクレオチドのピークはそれぞれ18S及び28SリボソームRNAである。小さなRNA領域は約150ヌクレオチドに位置する。
ゲル抽出は、アダプタープライマーから離れた小さな RNA シーケンシング ライブラリを分離するために使用できます。切除前に、各サンプルに多数の製品サイズが存在します。サイズ選択前後のキャピラリー電気泳動トレースは、ゲル精製後の150塩基対ライブラリー製品の純度の向上を示す。
このプロトコルは、単一のサンプルから小さなRNAシーケンシングライブラリとバルクmRNAシーケンシングライブラリの両方にRNA準備を分割するように設計しました。これは、マイクロRNA発現だけでなく、どのmRNA標的が発現したマイクロRNAによって調節され得るのかを取り巻く質問に対処する。この技術により、最も高発現度のマイクロRNAの包括的な見解と、胃管閉閉と神経管閉鎖の間の頭蓋神経堤細胞における標的の調節を得ることが可能になった。
