이 프로토콜은 배아 발달을 조절하는 microRNA를 정확하게 프로파일링하기 위해 초기 배아에서 낮은 입력, 작은 RNA 시퀀싱 라이브러리의 준비를 단순화하는 것을 목표로합니다. 이 기술의 장점은 낮은 입력 샘플의 풀링을 방지하고 정렬되지 않은 셀과 정렬되지 않은 셀 모두에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 우리는 또한 복제 사이 이체를 피하기 위하여 주의깊은 태아 준비를 보여줍니다.
이 방법은 입력 RNA 농도가 낮은 시간, 유전 적 및 발달 연구 또는 기타 응용 프로그램에 적용 될 수있다. 미래에, 이 방법은 microRNAs가 소화기능 증이 있는 발달 무질서를 진단하기 위하여 잠재적으로 이용될 수 있었습니다. 이 프로토콜의 가장 기술적으로 도전적인 부분은 배아 해부입니다.
각 배아는 세포 생존가능성을 보장하기 위해 해부, 단계, 이미지 및 신속하게 해리되어야 하기 때문입니다. 배아를 해부하려면 임신한 여성 마우스의 자궁을 PBS로 헹구고 멸균 플라스틱 10센티미터 접시에 놓습니다. 미세 절 가위를 사용하여 부위를 포함하는 데시두아를 분리하고 자궁 근육을 벗겨 모든 데시두아를 노출시하십시오.
배아를 해부하려면 임신한 여성 마우스의 자궁을 PBS로 헹구고 멸균 플라스틱 10센티미터 접시에 놓습니다. 미세 절 가위를 사용하여 데시두아 를 포함하는 영역을 분리합니다. 모든 배아를 깨끗한 PBS로 새로운 접시로 옮기고 전체 쓰레기의 이미지를 찍습니다.
그런 다음 각 배아를 개별적으로 이미지화하고 소미트 수를 계산하여 실험 사이에 배율과 노출을 일정하게 유지합니다. E8.0보다 오래된 배아의 경우, 오틱 플라코드 바로 위에 참수하고 머리를 48웰 플레이트의 깨끗한 우물로 옮춥니다. 250 마이크로리터의 파고통을 우물에 넣고 부드럽게 위아래로 파이펫을 넣습니다.
현미경을 사용하여 덩어리를 확인하고 단일 셀 서스펜션이 달성 될 때까지 위아래로 파이펫을 계속하십시오. 그런 다음 250 마이크로리터의 FBS를 세포에 추가하고 35 마이크로미터 나일론 메쉬 필터를 통해 서스펜션의 500 마이크로리터를 필터링합니다. 여과물을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 200 x g로 아래로 회전합니다.
상체를 새로운 튜브로 옮기고, BSA를 사용하여 PBS의 300 마이크로리터에서 세포 펠릿을 재연한다. 필터 캡 튜브를 통해 다시 필터를 정렬하고 얼룩 라이브 셀에 DAPI를 추가 할 준비가되면. 70 마이크로미터 노즐이 있는 셀 선별기를 사용하여 각 샘플을 RNA 추출 용액 500 마이크로리터로 정렬한 다음 샘플을 음수 섭씨 80도에 혼합하고 저장합니다.
각 샘플에 6X 로딩 염료 5개를 추가하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 샘플을 첫 번째 우물에서 후자와 시작하여 각 샘플 사이에 하나의 레인을 남기는 6% TBE 폴리아크라이글라미드 젤에 적재합니다. 0.5배 TBE 실행 버퍼에서 30~40분 동안 150볼트에서 젤을 실행합니다.
젤이 작동을 마쳤을 때, 조심스럽게 유리 판에서 제거하고 방향을 지적, 원래 포장에서 트레이에 배치합니다. 러닝 버퍼를 제거하고 젤을 15분 동안 염색합니다. 그리고 UV 트랜스 조명기에서 이미지를 이미지합니다.
150개의 베이스 쌍에서 밴드를 식별하고 깨끗한 면도날을 사용하여 소비합니다. 130개의 기본 쌍에서 어댑터 디머 제품을 피해야 합니다. 젤 슬라이스를 미세 원심 분리 튜브에 넣고 30 초 동안 최대 속도로 회전하십시오.
다음으로 P200 팁을 사용하여 젤 슬라이스를 가능한 가장 작은 비트로 분쇄하고 팁을 튜브로 배출합니다. 각 튜브에 용출 버퍼 300 마이크로리터를 추가하여 옆에서 젤 비트를 세척합니다. 파이펫 팁을 다시 부착하고 튜브에서 제거하기 전에 씻어 냅니다.
1, 000 RPM 흔들림과 함께 섭씨 25도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날, 10 분 동안 최대 속도로 그들을 회전하고 RNase가없는 96 웰 플레이트로 상류체를 전송합니다. 각 샘플과 파이펫에 50 마이크로리터의 클렉업 비드를 넣고 섞어 넣습니다.
그런 다음 350 마이크로리터의 이소프로판올을 추가하고 샘플을 혼합하고 흔들면서 실온에서 플레이트를 10 분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 접시를 당기고 2 분 동안 자화하십시오. 상체를 버리고 구슬을 80%의 950 마이크로리터로 30초 동안 세척합니다.
시료를 3분간 건조한 다음 우물 바닥에 있는 모든 잔류 액체를 제거합니다. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 그리고 재서스펜션 버퍼의 13 마이크로리터에서 구슬을 다시 중단한다.
플레이트를 2분 동안 배양한 다음 3분 동안 마그네틱 스탠드로 다시 옮습니다. 12 마이크로리터를 깨끗한 튜브로 옮기고 섭씨 4도 또는 장기에서 섭씨 20도에 보관하십시오. E7.5, E8.5 및 E9.5의 배아를 수확했습니다.
그리고 소미트는 6 시간 간격을 해결하기 위해 준비. 원리 성분 분석이 유사성에 따라 샘플을 그룹화하는 데 사용되었을 때, 샘플이 연령별로 클러스터되는 것으로 나타났습니다. 전철 및 철새 신경 문장 세포는 Wnt1-Cre와 Sox10-Cre를 가진 E8.5 및 E9.5로 표지되었습니다.
두 CRE 드라이버의 비교는 초기 마우스 배아에 있는 다른 인구를 표시한다는 것을 확인합니다. RNA는 분광계 및 모세관 전기포고증으로 정량화되었다. 분광계 추적은 RNA에 오염 단백질과 높은 세포 농도가 포함되어 있지 않다는 것을 밝혔지만, 나이가 들면서 RNA 농도의 변화를 감지하기에 충분히 민감하지 않았다.
모세관 전기 포근 추적은 RNA 단편의 농도 및 크기를 추정하는 데 사용될 수 있다. 2, 000 및 5, 100 뉴클레오티드에서 의 피크는 각각 18S 및 28S 리보소말 RNA이다. 작은 RNA 지역은 대략 150의 뉴클레오티드에 있는 동안.
겔 추출은 어댑터 프라이머로부터 작은 RNA 염기서열 분석 라이브러리를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 절제하기 전에 각 샘플에 다양한 제품 크기가 존재합니다. 모세관 전기포고는 크기 선택 전후에 겔 정화 후 150개의 베이스 페어 라이브러리 제품의 순도가 향상된 것을 보여준다.
우리는 작은 RNA 시퀀싱 라이브러리와 벌크 mRNA 시퀀싱 라이브러리로 단일 샘플에서 RNA 준비를 분할하는이 프로토콜을 설계했다. 이것은 microRNA 발현뿐만 아니라 어떤 mRNA 표적이 표현된 microRNA에 의해 규제될 수 있는 를 둘러싼 질문을 다룰 것입니다. 이 기술은 우리가 가장 높게 표현된 microRNAs의 포괄적인 보기 및 위화와 신경관 폐쇄 사이 두개골 신경 문장 세포에 있는 그들의 표적의 규정을 얻기 위하여 가능하게 했습니다.
