التهاب الجلوميرولونية يسبب إصابة الكبيات المرضية مع موت الخلايا كبيرة وإطلاق الحمض النووي خارج الخلية. هذا البروتوكول يتيح تصور الحمض النووي خارج الخلية في موقع الإفراج أثناء الإصابة المرضية. وميزة هذه التقنية هي أنه يقيس الحمض النووي خارج الخلية من موت الخلايا في الكلى.
على عكس المصل أو البول ، فإن قياس الحمض النووي خارج الخلية هو علامة بديلة للضرر المرضي. أهمية هذه الطريقة هي أن كلا من تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية وتحليل الصور يمكن نقلها بسهولة إلى أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والذئبة. هذه الطريقة تتطلب معرفة أساسية من الأنسجة الكلى.
لتمكين الكشف الدقيق للحمض النووي الكبيّة خارج الخلية ، يجب أن يكون الباحث قادرًا على تحديد الكبيات بشكل صحيح. لطخ الحمض النووي خارج الخلية، أولا تسخين العينات من الفائدة في رف الشريحة في 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة قبل غمر الشرائح في اثنين من التغييرات 40 دقيقة من المذيبات في غطاء الدخان. بعد الغمر الثاني، اُعاد هيدرات العينات مرتين في 100٪ الإيثانول، ومرّة واحدة في 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكلّ علاج.
بعد العلاج الأخير، واستخدام ملقط لوضع الشرائح في حل استرجاع المستضد الغليان في طنجرة الضغط على ارتفاع لمدة 10 دقائق. بعد كشف الغطاة المستضد، نقل طنجرة الضغط من الحرارة إلى بالوعة وتشغيل المياه الصنبور الباردة على الفور على الغطاء. السماح للشرائح لتكواز لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد قبل غسل العينات مرتين في 0.01 PBS الضرس على شاكر المداري لمدة خمس دقائق لكل غسل.
بعد الغسيل الثاني، استخدم قلماً محمّضًا لرسم دوائر حول عينات أنسجة الكلى ومنع أي تلطيخ غير محدد مع 60 ميكروليتر من مصل الدجاج 10٪ في 5٪ من البوم المصل البقري لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، بعناية استبدال حل حجب مع 60 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في غرفة الرطوبة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، اغسل الشرائح على شاكر مداري في PBS لمدة دقيقتين لكل غسيل قبل إضافة 60 ميكرولترات من جسم مضاد ثانوي مناسب من الفلوروفور إلى كل شريحة لاحتضان لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني كما هو موضح، تليها العلاج في 0.3٪ أسود السودان في 70٪ الإيثانول لإخماد أي الفلورورس المحتملة التي تسبب في شكلين. بعد 30 دقيقة، قم بغسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة أي ترسبات وغمر الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق لمنع أي تشكيل اعجال أسود في السودان. في نهاية الحضانة، قم بتركيب الشرائح على أغطية الزجاج confocal مع ثلاث قطرات 60 ميكرولتر من حل التركيب تكملها DAPI وختم الأغطية مع طلاء الأظافر.
السماح للشرائح لعلاج لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزينها في أربع درجات مئوية محمية من الضوء حتى التصوير عن طريق التصوير المجهري ليزر confocal وفقا للبروتوكولات القياسية. تأكد من ختم الأغطية بتلميع الأظافر لمنع أي حركة أثناء التصوير وتنظيف أغطية الإيثانول لتحسين دقة التصوير.
بعد التصوير 20 glomeruli لكل شريحة، فتح تدريب تجزئة Weka البرنامج المساعد في ImageJ وإسقاط الصورة الأولى على شريط الأدوات ImageJ. انقر فوق الصور والألوان والقنوات المنقسمة. ستظهر صورة تُظهر تلطيخ الأجسام المضادة الأساسية.
لإنشاء ملف مدمج للصور الفردية، انقر فوق قنوات الألوان والدمج. سيظهر مربع منبثق يطلب تعيين لون لكل قناة. تحقق من إنشاء مركّب والاحتفاظ بالمصادر صور مربعات وانقر فوق موافق. ستظهر صورة مركبة مدمجة.
باستخدام الجسم المضاد الرئيسي تلطيخ كدليل، رسم منطقة من الاهتمام حول خصلة الكبيات. لتنفيذ طمس غاوسي على صورة DAPI زرقاء واحدة، انقر فوق عملية، والمرشحات، وطمس غاوسي. تعيين طمس في واحد إلى اثنين.
سوف تصبح الصورة ضبابية قليلا، ولكن سوف تظهر على نحو سلس نواة، سيتم تخفيف الخلفية. بعد ذلك ، انقر فوق الإضافات ، والتجزئة ، وتجزئة Weka القابلة للتدريب ، واستخدام أداة اليد الحرة لتتبع النوى سليمة. عندما تم إضافة كافة النوى من الفائدة، إضافة فئة مربع واحد، استخدم أداة خط لتحديد مساحات الخلفية إلى مربع الفئة اثنين.
انقر فوق إنشاء فئة جديدة واستخدام أداة الخط لتحديد الحمض النووي خارج نونويلر الملطخة بـ DAPI. انقر فوق مصنف القطار والحصول على احتمال. قم بتبديل الماوس للحصول على صورة بالأبيض والأسود لكافة المكونات مع تمييز كائن التحديد باللون الأبيض.
لتكرار هذه الصورة، انقر فوق الصورة ثم انقر فوق التكرار. تحت الصورة، وضبط وعتبة. استخدم زر الماوس لضبط العتبة حتى يتم ملاحظة الحمض النووي خارج الخلية فقط.
بعد العتبة، انقر فوق عملية، ثنائي، وجعل ثنائي، ونسخ المنطقة الكبيات التي تم إنشاؤها سابقا من الفائدة. اضغط على Control Shift E لتحديد التحرير والتحديدات والاستعادة لاستعادة التحديد. لقياس فقط جزيئات الحمض النووي خارج الخلية داخل الكبيات، انقر فوق تحليل الجسيمات و OK. سيتم إنشاء ورقة نتائج توضح عدد الجسيمات والمساحة والبكسل المتوسط والنسبة المئوية للحمض النووي الكبيبات التي تحتوي على الحمض النووي خارج الخلية.
لحفظ المصنف كمصنف الحمض النووي خارج الخلية، انقر فوق حفظ المصنف وحفظ البيانات. لإعادة تطبيق الطراز على الصور اللاحقة، كرر معالجة الصورة الأولية كما هو موضح قبل تحديد مصنف التحميل وملف المصنف المحفوظ. قائمة السجل سوف يطفو على المنبثقة وتشغيل النموذج.
بمجرد تشغيل النموذج، انقر فوق تحميل البيانات وحدد extracellularDNA.arff. ثم انقر فوق إنشاء نتيجة. إذا فشلت الصورة الناتجة في التقاط جميع النوى أو الخلفية أو الحمض النووي خارج الخلية، فانقر على مصنف إعادة التدريب وإضافة المزيد من المصنفات حسب الضرورة.
هنا، تظهر صور قناة واحدة الحمض النووي التمثيلي وتلطيخ بيتا أكتين. دمج الصورتين يسمح منطقة ذات أهمية أن يتم رسمها حول المنطقة الكبيبية لقياس الحمض النووي خارج الخلية داخل كبيبات الكلى الماوس باستخدام تجزئة Weka التدريب كما هو موضح. يمكن اعتماد هذا النموذج لتحديد الحمض النووي خارج الخلية في عينات خزعة الكلى من مريض التحكم أو مقارنة مع خزعة الكلى من مريض مصاب بالتهاب الأوعية الدموية المرتبط بـ ANCA.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ترجمة هذا البرنامج إلى بقع أخرى داخل عينات أنسجة الكلى، على سبيل المثال، إلى وصمة عار عن الفخاخ العدلات خارج الخلية وترسب النخاع خارج الخلية في التهاب الأوعية الدموية المرتبط ANCA. الأهم من ذلك، لا توجد اختلافات كبيرة عند تحليل نفس البيانات من قبل عدة مستخدمين. الخطوة الأكثر أهمية من التحليل هو تقديم ما يكفي من الأمثلة من الخلفية، النوى، والحمض النووي خارج الخلية مع كبيبات كمصنفات لبرنامج تجزئة ويكا للتعلم من.
هذا الأسلوب قابل للتحويل بسهولة. على سبيل المثال، يمكن إجراء مزيد من التحليل لأنواع مختلفة من موت الخلايا من خلال التلطيخ للأجسام المضادة المحددة ضد علامات ل المبرمج أو النخر. يمكن استخدام أسلوبنا مع العمليات الالتهابية الأخرى مثل تقييم تعبير TLR في أمراض الكلى الذاتية أو تعبير النخاع خارج الخلية في خزعات الكلى البشرية.
