糸球体腎炎は、かなりの細胞死および細胞外DNA放出で病理学的糸球体損傷を引き起こす。このプロトコルは病理学的傷害の間に放出の場所で細胞外DNAの視覚化を可能にする。この技術の利点は、腎臓における細胞死から細胞外DNAを測定することです。
血清または尿とは対照的に、細胞外DNA測定は病理学的損傷の代理マーカーである。この方法の意義は、細胞外DNA染色と画像解析の両方が、関節リウマチやルプスなどの他の自己免疫疾患に容易に転移できることである。この方法は腎臓の神学の基礎知識を必要とする。
糸球体細胞外DNAを正確に検出するには、研究者が糸球体を正しく識別できる必要があります。細胞外DNA染色の場合、まず目的のサンプルを60°Cで摂氏60度で加熱してから、スライドをヒュームフードに40分間の溶媒の2回の変化に浸します。2回目の浸漬後、100%エタノールでサンプルを2回、1回の処理で5分間70%エタノールで1回再水和します。
最後の処理の後、トングを使用して、10分間高い圧力鍋で沸騰抗原検索溶液にスライドを置きます。抗原エピトープのマスクを解除した後、圧力鍋を熱からシンクに移し、すぐに蓋の上に冷たい水道水を流します。スライドが抗原検索溶液で20分間平衡化してから、1回の洗浄で軌道シェーカー上の0.01モルPBSでサンプルを2回洗浄します。
2回目の洗浄後、疎水性ペンを使用して腎臓組織サンプルの周りに円を描き、室温で30分間、5%ウシ血清アルブミンで10%チキン血清の60マイクロリットルで非特異的染色をブロックします。インキュベーションの終了時に、ブロッキング溶液を、摂氏4度で一晩湿度チャンバーに目的とする一次抗体の60マイクロリットルに慎重に交換します。翌朝、PBSの軌道シェーカーでスライドを1回2分間洗浄してから、適切なフルオロフォア共役二次抗体の60マイクロリットルを各スライドに加え、室温で40分間インキュベーションします。
インキュベーションの終わりに、示されているようにPBSでスライドを洗浄し、続いて70%エタノール中の0.3%スーダンブラックで治療を行い、潜在的なホルマリン誘発自己蛍光を消し止める。30分後、蛇口でスライドを洗い流して沈殿物を取り除き、スライドをPBSに10分間浸して、スーダンの黒い沈殿物の形成を防ぎます。インキュベーションの最後に、DAPIを補った3つの60マイクロリットルの取り付け溶液でスライドをコンフォーカルガラスカバーリップに取り付け、カバーリップをマニキュアで密封します。
スライドを室温で24時間硬化させます。標準プロトコルに従って共焦点レーザー走査顕微鏡法によって画像化まで光から保護された4°Cで保存します。イメージング中の動きを防ぎ、エタノールのカバーリップを洗浄してイメージング解像度を高めるために、マニキュアでカバーリップを密封してください。
スライドあたり20のグロメルリをイメージングした後、ImageJでトレーニング可能なWekaセグメンテーションプラグインを開き、ImageJツールバーに最初の画像をドロップします。画像、色、分割チャンネルをクリックします。一次抗体染色を示す画像が現れます。
単一の画像のマージファイルを作成するには、カラーをクリックしてチャンネルを結合します。各チャンネルに色を割り当てるように求めるポップアップボックスが表示されます。[合成を作成]ボックスをオンにし、[ソースイメージを保持]ボックスをオンにして、[OK]をクリックします。合成画像が合成されます。
一次抗体染色をガイドとして使用し、糸球体房の周りに関心領域を描く。単一の青色の DAPI イメージにガウス ブラーを実行するには、プロセス、フィルター、およびガウス ブラーをクリックします。ぼかしを1~2に設定します。
画像は少しぼやけますが、核は滑らかに表示され、背景は柔らかくなります。次に、プラグイン、セグメンテーション、およびトレーニング可能なWekaセグメンテーションをクリックし、フリーハンドツールを使用して無傷の核をトレースします。対象となるすべての核が追加されたら、クラス 1 ボックスを追加し、ライン ツールを使用して、バックグラウンド領域をクラス 2 ボックスに示します。
[新しいクラスを作成]をクリックし、ラインツールを使用してDAPI染色された核外DNAの概要を説明します。[列車分類器]をクリックして、確率を取得します。マウスを切り替えて、選択オブジェクトが白でハイライト表示されたすべてのコンポーネントの白黒画像を取得します。
この画像を複製するには、[画像] をクリックして複製します。[画像] で調整し、しきい値を設定します。マウスボタンを使用して、細胞外DNAのみが観察されるまでしきい値を調整します。
しきい値を設定した後、プロセス、バイナリ、バイナリを作成をクリックし、以前に生成された関心のある糸球体領域をコピーします。Ctrl Shift E キーを押して、編集、選択、復元を選択して選択を復元します。糸球体内の細胞外DNA粒子のみを測定するには、「粒子を分析」をクリックしてOK。細胞外DNAを含む糸球体の粒子数、面積、平均画素、およびパーセンテージを示す結果シートが生成される。
分類子を細胞外 DNA 分類子として保存するには、[分類器を保存] をクリックしてデータを保存します。モデルを後続のイメージに再適用するには、ロード分類器と保存済み分類子ファイルを選択する前に、示されているように初期イメージ処理を繰り返します。ログメニューがポップアップしてモデルが実行されます。
モデルが実行されたら、[データのロード] をクリックし、セルラーDNA.arff外を選択します。次に、[結果の作成] をクリックします。結果として得られた画像がすべての核、背景、または細胞外DNAを拾うことができなかった場合は、分類器を再訓練をクリックし、必要に応じて分類器を追加します。
ここで、代表的なDNAおよびβアクチン染色を示す単一チャネル画像が示されている。2つの画像をマージすると、トレーニング可能なWekaセグメンテーションを使用して、マウス腎臓糸球体内の細胞外DNAを測定するために糸球体領域の周りに関心のある領域を描くことができる。このモデルは、コントロール患者から腎臓生検検体中の細胞外DNAを同定したり、骨髄ペルオキシダーゼANCA関連血管炎患者の腎臓生検と比較するために採用することができる。
さらに、このプログラムは、腎臓組織サンプル内の他の染色に翻訳することができ、例えば、好中球外細胞トラップの染色およびANCA関連血管炎における細胞外骨髄ペルオキシダーゼの沈着に。重要なのは、複数のユーザーが同じデータを分析する場合、有意な差は見られないことです。解析の最も重要なステップは、Wekaセグメンテーションプログラムの分類者として糸球体を持つ背景、核、および細胞外DNAの十分な例を提供することです。
この方法は簡単に譲渡可能です。例えば、異なるタイプの細胞死のさらなる分析は、アポトーシスまたは壊死に対するマーカーに対する特定の抗体の染色を通じて調べることができる。我々の技術は、自己免疫腎疾患におけるTLR発現の評価やヒト腎臓生検における細胞外骨髄ペルオキシダーゼ発現などの他の炎症プロセスと共に使用することができる。
