Glomerulonephritis גורם לפציעה גלומרולרית פתולוגית עם מוות תאי ניכר ושחרור DNA חוץ תאי. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של דנ"א חוץ-תאי באתר השחרור במהלך פגיעה פתולוגית. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מודדת דנ"א חוץ תאי מהמוות של התאים בכליה.
בניגוד לסרום או שתן, מדידת DNA חוץ-תאית היא סמן פונדקאי לנזק פתולוגי. המשמעות של שיטה זו היא כי הן כתמי DNA חוץ תאיים וניתוח תמונה ניתנים להעברה בקלות למחלות אוטואימוניות אחרות כגון דלקת מפרקים שגרונית זאבת. שיטה זו דורשת ידע בסיסי בהיסטולוגיה של הכליות.
כדי לאפשר זיהוי מדויק של דנ"א חוץ-תאי גלומרולרי, החוקר חייב להיות מסוגל לזהות כראוי גלומרולי. עבור כתמי DNA חוץ-תאיים, מחממים תחילה את דגימות העניין במתלה שקופיות ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפני שהם טובלים את המגלשות בשני שינויים של 40 דקות של ממס במכסה המנוע. לאחר הטבילה השנייה, rehydrate את הדגימות פעמיים 100% אתנול ופעם אחת ב 70% אתנול במשך חמש דקות לטיפול.
לאחר הטיפול האחרון, להשתמש מלקחיים למקם את המגלשות לתוך פתרון אחזור אנטיגן רותחים סיר לחץ על גבוה במשך 10 דקות. לאחר חשיפה של אפיטופים אנטיגן, להעביר את סיר הלחץ מהחום לתוך כיור מיד להפעיל מי ברז קרים מעל המכסה. אפשר את השקופיות כדי לצייד במשך 20 דקות בתתבר אחזור אנטיגן לפני שטיפת הדגימות פעמיים ב 0.01 PBS טוחן על שייקר מסלולית במשך חמש דקות לכל לשטוף.
לאחר הכביסה השנייה, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב דגימות רקמת הכליה ולחסום כל כתם לא ספציפי עם 60 מיקרוליטרים של סרום עוף 10% ב 5% אלבומין סרום bovine במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, בזהירות להחליף את פתרון החסימה עם 60 microliters של הנוגדן העיקרי של עניין בתא לחות לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לשטוף את המגלשות על שייקר מסלולית ב PBS במשך שתי דקות לכל לשטוף לפני הוספת 60 microliters של נוגדן פלואורופור מתאים הוסיף נוגדן משני לכל שקופית עבור דגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות PBS כפי שהוכח, ואחריו טיפול 0.3% סודן שחור ב 70% אתנול כדי להתוות כל שפעת אוטומטית הנגרמת על ידי פורמלין פוטנציאלי. לאחר 30 דקות, לשטוף את המגלשות במי ברז כדי להסיר כל משקע לטבול את המגלשות PBS במשך 10 דקות כדי למנוע כל היווצרות משקע שחור סודן נוסף. בסוף הדגירה, הר את השקופיות על כיסויי זכוכית קונפוקלית עם שלוש 60 טיפות מיקרוליטר של פתרון הרכבה בתוספת DAPI ולאטום את כיסויי עם לק.
אפשר לשקופיות לרפא במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד הדמיה על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. הקפד לאטום את כיסויים עם לק כדי למנוע כל תנועה במהלך הדמיה כדי לנקות את הכיסויים של אתנול כדי לשפר את רזולוציית ההדמיה.
לאחר הדמיית 20 glomeruli לכל שקופית, לפתוח את תוסף פילוח Weka להתאמה ImageJ ושחרר את התמונה הראשונה על סרגל הכלים ImageJ. לחצו על 'תמונה', 'צבע' ו'פיצול ערוצים'. תמונה המציגה את כתמי הנוגדנים העיקריים תופיע.
ליצירת קובץ ממוזג של התמונות הבודדות, לחצו על 'צבע' ומזגו ערוצים. תופיע תיבה מוקפצת המבקשת להקצות צבע לכל ערוץ. סמן את תיבות יצירת תמונות המקור ללא הפרדות צבע ושמור אותן ולחץ על אישור. תמונה ללא הפרדות צבע ממוזגת תופיע.
שימוש בכתמי הנוגדנים העיקריים כמדריך, צייר אזור מעניין סביב הטופט גלומרולרי. לביצוע טשטוש גאוסיאני על תמונת DAPI כחולה אחת, לחצו על 'תהליך', 'מסננים' ו'טשטוש גאוסיאני'. תן לטשטוש 1 עד 2.
התמונה תהפוך קצת מטושטשת, אבל הגרעינים ייראו חלקים, הרקע יהיה מרוכך. לאחר מכן, לחץ על תוספים, פילוח, ו- Weka פילוח להתאמה, ולהשתמש בכלי היד החופשית כדי לעקוב אחר הגרעינים שלמים. לאחר הוספת כל הגרעינים המעניינים, התיבה הוסף מחלקה אחת, השתמש בכלי הקו כדי לתווים את אזורי הרקע לתיבה מחלקה 2.
לחץ על צור מחלקה חדשה ולהשתמש בכלי הקו כדי לחלק לרמות את הדנ"א החוץ-גרעיני המוכתם ב- DAPI. לחץ על מסווג הרכבת ו קבל הסתברות. החלף מצב העכבר כדי לקבל תמונה בשחור-לבן של כל הרכיבים כאשר אובייקט הבחירה מסומן בלבן.
כדי לשכפל תמונה זו, לחץ על תמונה ושכפל. תחת תמונה, התאם סף. השתמש בלחצן העכבר כדי להתאים את הסף עד שרק הדנ"א החוץ-תאי נצפה.
לאחר סף, לחץ על תהליך, בינארי והפוך לקובץ בינארי והעתק את אזור העניין גלומרולרי שנוצר קודם לכן. הקש Control Shift E כדי לבחור עריכה, בחירות ושחזור כדי לשחזר את הבחירה. כדי למדוד רק את חלקיקי הדנ"א החוץ-תאיים בתוך הגלומרולוס, לחץ על נתח חלקיקים וסדר. גליון תוצאות המציג את מספר החלקיקים, האזור, הפיקסלים הממוצעים ואחוזי הגלומרולי המכילים דנ"א חוץ-תאי ייווצרו.
כדי לשמור את המסווג כמסווג דנ"א חוץ-תאי, לחץ על שמור מסווג ושמור את הנתונים. כדי להחיל מחדש את הדגם על התמונות הבאות, חזור על עיבוד התמונה הראשוני כפי שהודגם לפני בחירת מסווג העומס וקובץ המסווג שנשמר. תפריט יומן הרישום יצץ ויפעיל את הדגם.
לאחר הפעלת המודל, לחץ על טען נתונים ובחר את ה- extracellularDNA.arff. לאחר מכן לחץ על צור תוצאה. אם התמונה המתקבלת לא הצליחה לקלוט את כל הגרעינים, הרקע או הדנ"א החוץ-תאי, לחץ על מסווג הסבה מחדש והוסף מסווגים נוספים לפי הצורך.
כאן מוצגות תמונות ערוץ יחיד המציגות כתמי דנ"א מייצגים וכתמי בטא אקטין. מיזוג שתי התמונות מאפשר אזור מעניין להימשך סביב האזור גלומרולרי למדידת ה-DNA החוץ תאי בתוך גלומרולי הכליות של העכבר באמצעות פילוח Weka להתאמה כפי שהוכח. מודל זה יכול להיות מאומץ כדי לזהות DNA חוץ תאית בדגימות ביופסיה של הכליה מחולה בקרה או השוואה לזה של ביופסיה בכליות מחולה עם דלקת כליות הקשורים MYELoperoxidase ANCA.
בנוסף, תוכנית זו יכולה להיות מתורגמת כתמים אחרים בתוך דגימות רקמת הכליה, למשל, כדי להכתים עבור מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים ותצהיר של myeloperoxidase חוץ תאיים בדלקת כלי דם הקשורים ANCA. חשוב לציין, אין הבדלים משמעותיים נצפים כאשר אותם נתונים מנותחים על ידי משתמשים מרובים. השלב הקריטי ביותר של הניתוח הוא לספק מספיק דוגמאות של רקע, גרעינים, ו- DNA חוץ תאי עם glomeruli כמסווגים עבור תוכנית פילוח Weka ללמוד.
שיטה זו ניתנת להעברה בקלות. לדוגמה, ניתוח נוסף של סוגים שונים של מוות תאי ניתן לחקור באמצעות כתמים עבור נוגדנים ספציפיים נגד סמנים עבור אפופטוזיס או נמק. הטכניקה שלנו יכולה לשמש עם תהליכים דלקתיים אחרים כגון הערכת ביטוי TLR במחלת כליות אוטואימונית או ביטוי myeloperoxidase חוץ תאי בביופסיות כליות אנושיות.
