구종염은 상당한 세포 죽음과 세포 외 DNA 방출을 가진 병리학적인 구체 상해를 일으키는 원인이 됩니다. 이 프로토콜은 병리학적 상해 도중 방출의 사이트에 세포외 DNA의 시각화를 가능하게 합니다. 이 기술의 장점은 신장에 있는 세포 죽음에서 세포 외 DNA를 측정한다는 것입니다.
혈청이나 소변과는 달리 세포외 DNA 측정은 병리학적 손상을 위한 대리 마커입니다. 이 방법의 중요성은 세포외 DNA 염색 및 이미지 분석 모두 류마티스 관절염 및 루푸스와 같은 다른 자가 면역 질환으로 쉽게 전달될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신장 조직학에 대한 기본적인 지식이 필요합니다.
사구세포 DNA의 정확한 검출을 가능하게 하기 위하여는, 연구원은 정확하게 사구체를 식별할 수 있어야 합니다. 세포 외 DNA 염색의 경우, 먼저 60섭씨 60도의 슬라이드 랙에 관심있는 샘플을 가열한 후 연기 후드에 용매의 두 가지 40 분 변경에 슬라이드를 침지하십시오. 두 번째 침수 후, 시료를 100%에탄올로 2회, 70%에 탄올로 1회 재수화하여 치료당 5분간 재수화한다.
마지막 치료 후 집게를 사용하여 슬라이드를 끓는 항원 검색 용액에 10 분 동안 높은 압력 밥솥에 넣습니다. 항원 전형의 마스킹을 해제한 후 압력 솥을 열에서 싱크대로 옮기고 뚜껑 위로 차가운 수돗물을 즉시 실행합니다. 슬라이드가 항원 검색 용액에서 20분 동안 평형화한 후 시료를 0.01 대구시 PBS에서 0.01 의 어금니 PBS로 2회 세척한 후 세척당 5분간 평형화할 수 있도록 한다.
두 번째 세척 후, 소수성 펜을 사용하여 신장 조직 샘플 주위에 원을 그리고 실온에서 30 분 동안 5 %의 소 세럼 알부민에 10 %의 닭 세럼60 마이크로 리터로 비특이적 염색을 차단하십시오. 인큐베이션이 끝나면 블로킹 용액을 섭씨 4도에서 밤새 습도 챔버에 대한 관심있는 1 차 항체의 60 마이크로 리터로 조심스럽게 교체하십시오. 다음 날 아침, PBS의 궤도 셰이커에서 슬라이드를 세척당 2분 동안 세척한 후 각 슬라이드에 40분 간 배양할 수 있는 적절한 플루오로포어 의 마이크로리터 60마이크로리터를 추가합니다.
인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 PBS에서 슬라이드를 세척하고, 70%에탄올에서 0.3%의 수단 블랙으로 처리하여 잠재적인 포르말린 유도 자동 불광을 담금질한다. 30분 후, 슬라이드를 수돗물로 씻어 침전물을 제거하고 10분 동안 PBS에 슬라이드를 담그어 수단 의 검은 침전물을 더 이상 방지합니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 공초점 유리 커버립에 장착하여 DAPI로 보완된 장착 용액 30방울을 장착하고 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.
슬라이드가 실온에서 24시간 동안 치료하도록 허용합니다. 표준 프로토콜에 따라 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법에 의해 이미징될 때까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 보관하십시오. 이미징 중 의 움직임을 방지하고 이미징 해상도를 향상시키기 위해 에탄올의 커버립을 청소하기 위해 매니큐어로 커버립을 밀봉해야합니다.
슬라이드 당 20 glomeruli 이미징 후 ImageJ에서 기차 가 가능한 Weka 세분화 플러그인을 열고 첫 번째 이미지를 ImageJ 도구 모음에 놓습니다. 이미지, 색상 및 분할 채널을 클릭합니다. 1차 항체 염색을 보여주는 이미지가 나타납니다.
단일 이미지의 병합된 파일을 만들려면 색상을 클릭하고 채널을 병합합니다. 각 채널에 할당할 색상을 요청하는 팝업 상자가 나타납니다. 합성 만들기를 확인하고 소스 이미지 상자를 유지하고 확인을 클릭합니다. 병합된 복합 이미지가 나타납니다.
1 차적인 항체 염색을 가이드로 사용하여, 사구체 tuft 의 주위에 관심의 영역을 그립니다. 단일 파란색 DAPI 이미지에서 가우시안 블러를 수행하려면 프로세스, 필터 및 가우시안 흐림 효과를 클릭합니다. 흐림 효과를 1~2로 설정합니다.
이미지는 약간 흐릿해지지만 핵이 매끄럽게 나타나고 배경이 부드러워집니다. 다음으로 플러그인, 세분화 및 훈련 가능한 Weka 세분화를 클릭하고 무료 핸드 도구를 사용하여 그대로 핵을 추적합니다. 관심있는 모든 핵이 추가되면 클래스 한 상자를 추가하여 라인 도구를 사용하여 배경 영역을 클래스 2 상자에 묘사합니다.
새 클래스를 만들고 라인 도구를 사용하여 DAPI 염색 된 외핵 DNA를 간략하게 설명하십시오. 기차 분류기를 클릭하고 확률을 얻을. 마우스를 전환하여 선택 객체가 흰색으로 강조 표시된 모든 구성 요소의 흑백 이미지를 얻습니다.
이 이미지를 복제하려면 이미지를 클릭하고 복제합니다. 이미지 에서 조정 및 임계값을 조정합니다. 마우스 버튼을 사용하여 세포외 DNA만 관찰될 때까지 임계값을 조정합니다.
임계값을 설정한 후 프로세스, 이진 을 클릭하고 이진을 만들고 이전에 생성된 가상 영역을 복사합니다. 제어 Shift E를 눌러 선택 선택을 복원하고 복원합니다. 사구체 내의 세포외 DNA 입자만 측정하려면 입자 분석 및 확인을 클릭합니다. 세포외 DNA를 함유한 입자, 면적, 평균 픽셀 및 소구체의 수를 보여주는 결과 시트가 생성될 것이다.
분류기를 세포외 DNA 분류자로 저장하려면 분류기를 저장하고 데이터를 저장합니다. 모델을 후속 이미지에 다시 적용하려면 로드 분류기 및 저장된 분류기 파일을 선택하기 전에 설명된 대로 초기 이미지 처리를 반복합니다. 로그 메뉴가 나타나 모델을 실행합니다.
모델이 실행되면 로드 데이터를 클릭하고 셀룰러DNA.arff를 선택합니다. 그런 다음 결과 만들기를 클릭합니다. 결과 이미지가 모든 핵, 배경 또는 세포 외 DNA를 선택하지 못한 경우 분류자를 다시 학습하고 필요에 따라 더 많은 분류기를 추가하십시오.
여기서, 대표적인 DNA와 베타 액틴 염색을 보여주는 단일 채널 이미지가 표시됩니다. 두 개의 이미지를 병합하면 입증된 대로 훈련 가능한 Weka 세분화를 사용하여 마우스 신장 사구체 내의 세포외 DNA를 측정하기 위해 사구 체영역 주위에 관심 영역을 그릴 수 있습니다. 이 모형은 대조군 환자에게서 신장 생검 견본에 있는 세포외 DNA를 확인하기 위하여 채택될 수 있고 또는 myeloperoxidase ANCA 관련 혈관염을 가진 환자에게서 신장 생검의 비교.
또한, 이 프로그램은 신장 조직 샘플 내의 다른 얼룩으로 번역될 수 있으며, 예를 들어, 중성구 세포 외 트랩및 ANCA 관련 혈관염에서 세포외 밀로페록시다제의 증착을 위해 얼룩으로 변환될 수 있다. 중요한 것은 여러 사용자가 동일한 데이터를 분석할 때 중요한 차이점은 관찰되지 않는다는 것입니다. 분석의 가장 중요한 단계는 Weka 세분화 프로그램에 대한 분류자로 구체와 배경, 핵 및 세포 외 DNA의 충분한 예를 제공하는 것입니다.
이 방법은 쉽게 양도 할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 사멸의 상이한 모형의 추가 분석은 세포사멸 또는 괴사에 대한 마커에 대하여 특정 항체를 위한 염색을 통해 조사될 수 있다. 우리의 기술은 인간 신장 생검에 있는 자가면역 신장 병 또는 세포외 myeloperoxidase 발현에 있는 TLR 발현을 평가하는 것과 같은 그밖 선동적인 프로세스와 함께 이용될 수 있습니다.
