Glomerülonefrit önemli hücre ölümü ve ekstrasellüler DNA salınımı ile patolojik glomerüler yaralanmaya neden olur. Bu protokol, patolojik yaralanma sırasında serbest bırakıldığı yerde hücre dışı DNA'nın görüntülenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin avantajı böbrekhücre ölümü ekstrahücre DNA ölçer olmasıdır.
Serum veya idrarın aksine, hücre dışı DNA ölçümü patolojik hasar için bir taşıyıcı belirteçtir. Bu yöntemin önemi hem ekstrasellüler DNA boyama ve görüntü analizi kolayca romatoid artrit ve lupus gibi diğer otoimmün hastalıklara aktarılabilir olmasıdır. Bu yöntem böbrek histolojisi temel bir bilgi gerektirir.
Glomerüler ekstrasellüler DNA'nın doğru saptanmasını sağlamak için, araştırmacı glomeruli doğru tanımlamak gerekir. Hücre dışı DNA boyama için, ilk ısı 60 santigrat derece bir slayt raf ilgi örnekleri 60 dakika boyunca bir duman kaputuna çözücü iki 40 dakikalık değişiklikler slaytlar daldırma önce. İkinci daldırma sonra, tedavi başına beş dakika için% 100 etanol iki kez ve% 70 etanol bir kez rehydrate.
Son tedaviden sonra, 10 dakika yüksek bir düdüklü tencerede kaynayan antijen alma çözeltisi içine slaytlar yerleştirmek için maşa kullanın. Antijen epitopsların maskesini attıktan sonra düdüklü tencereyi sıcaktan lavaboya aktarın ve hemen kapağın üzerinde soğuk musluk suyu çalıştırın. Slaytların, numuneleri 0,01 molar PBS'de iki kez yıkama başına beş dakika boyunca orbital shaker'da iki kez yıkamadan önce antijen alma çözeltisinde 20 dakika boyunca dengelemesine izin verin.
İkinci yıkamadan sonra, böbrek dokusu örnekleri etrafında daire çizmek ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albumin% 10 tavuk serum 60 mikrolitre ile nonspesifik boyama engellemek için bir hidrofobik kalem kullanın. Kuluçka sonunda, bir gecede nem haznesinde 4 santigrat derecede birincil antikor 60 mikrolitre ile engelleme çözeltisi değiştirin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında 40 dakikalık kuluçka için her slaytiçin uygun bir florofor konjuge ikincil antikor 60 mikrolitre eklemeden önce yıkama başına iki dakika PBS bir orbital shaker slaytlar yıkayın.
Kuluçka sonunda, pbs slaytlar gösterildiği gibi yıkayın, herhangi bir potansiyel formalin indüklenen otofloresan söndürmek için% 70 etanol% 0.3 Sudan siyah tedavi izledi. 30 dakika sonra, herhangi bir çökelti kaldırmak için musluk suyunda slaytlar yıkayın ve daha fazla Sudan siyah çökelti oluşumunu önlemek için 10 dakika PBS slaytlar batırın. Kuluçka sonunda, dapi ile takviye montaj çözeltisi üç 60 mikrolitre damla ile konfokal cam kapakları üzerine slaytlar monte ve oje ile kapakları mühür.
Slaytların oda sıcaklığında 24 saat boyunca tedavi etmesine izin verin. Standart protokollere göre konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüye kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme sırasında herhangi bir hareketi önlemek ve görüntüleme çözünürlüğünü artırmak için etanol kapakları temizlemek için oje ile kapakları mühür emin olun.
Slayt başına 20 glomeruli görüntüledikten sonra ImageJ'deki eğitilebilir Weka Segmentasyon eklentisini açın ve ilk görüntüyü ImageJ araç çubuğuna bırakın. Görüntü, renk ve bölünmüş kanalları tıklatın. Birincil antikor boyama gösteren bir görüntü görünür.
Tek görüntülerin birleştirilmiş dosyasını oluşturmak için renk ve birleştirme kanallarını tıklatın. Bir açılır pencere kutusu, her kanala atanacak bir renk isteyen görünür. Bileşik oluştur'u işaretleyin ve kaynak resim kutularını tutun ve Tamam'ı tıklatın. Birleştirilmiş bileşik görüntü görüntülenir.
Bir kılavuz olarak birincil antikor boyama kullanarak, glomerüler tuft etrafında ilgi bir bölge çizin. Tek mavi DAPI görüntüsünde Gaussian bulanıklığı gerçekleştirmek için işlem, filtreler ve Gaussian bulanıklığı tıklatın. Bulanıklığı 1'e iki olarak ayarlayın.
Görüntü biraz bulanık olacak, ama çekirdekleri pürüzsüz görünecektir, arka plan yumuşamış olacak. Ardından, eklentileri, segmentasyonu ve eğitilebilir Weka Segmentasyon'u tıklatın ve bozulmamış çekirdekleri izlemek için serbest el aracını kullanın. İlgi çeken tüm çekirdekler eklendiğinde, birinci sınıf ekle kutusu, arka plan alanlarını sınıf iki kutusuna göre sınıflandırmak için satır aracını kullanın.
Yeni sınıf oluştur'u tıklatın ve DAPI lekeli nükleer olmayan DNA'yı anahatlamak için satır aracını kullanın. Tren sınıflandırıcısı'nı tıklatın ve olasılık elde edin. Beyaz olarak vurgulanan seçim nesnesi ile tüm bileşenlerin siyah beyaz bir görüntü elde etmek için fareyi geçiş.
Bu resmi çoğaltmak için resmi tıklatın ve çoğaltın. Görüntü altında, ayarlayın ve eşik. Yalnızca hücre dışı DNA gözlemlenene kadar eşiği ayarlamak için fare düğmesini kullanın.
Eşik ten sonra, işlem, ikili tıklatın ve ikili yapmak ve ilgi daha önce oluşturulan glomerüler bölge kopyalayın. Düzenleme, seçim ve seçimi geri yüklemek için seçmek için Kontrol Kaydırma E tuşuna basın. Glomerulus içinde sadece hücre dışı DNA parçacıklarını ölçmek için, parçacıkları analiz ve Tamam'ı tıklatın. Parçacık sayısını, alanını, ortalama pikselleri ve hücre dışı DNA içeren glomerülin yüzdesini gösteren bir sonuç sayfası oluşturulacaktır.
Sınıflandırıcıyı hücre dışı DNA sınıflandırıcısı olarak kaydetmek için sınıflandırıcıyı kaydet'i tıklatın ve verileri kaydedin. Modeli sonraki görüntülere yeniden uygulamak için, yük sınıflandırıcısı ve kaydedilen sınıflandırıcı dosyasını seçmeden önce gösterildiği gibi ilk görüntü işlemini tekrarlayın. Günlük menüsü açılır ve modeli çalıştırın.
Model çalıştırdıktan sonra, yük verilerini tıklatın ve extracellularDNA.arff'ı seçin. Ardından sonuç oluştur'u tıklatın. Ortaya çıkan görüntü tüm çekirdekleri, arka planı veya hücre dışı DNA'yı almayı başaramadıysa, sınıflandırıcıyı yeniden eğit'i tıklatın ve gerektiğinde daha fazla sınıflandırıcı ekleyin.
Burada temsili DNA ve beta aktin boyama gösteren tek kanallı görüntüler gösterilmiştir. İki görüntünün birleştirilmesi, gösterildiği gibi eğitilebilir Weka Segmentasyonu kullanılarak fare böbrek glomerüli içindeki hücre dışı DNA'nın ölçülmesi için glomerüler alanın etrafına ilgi çekici bir bölge çizilmesine olanak sağlar. Bu model, kontrol eden bir hastadan alınan böbrek biyopsisi örneklerindeki hücre dışı DNA'yı belirlemek veya miyeloperoksidaz ANCA ilişkili vaskülitli bir hastanın böbrek biyopsisi ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir.
Buna ek olarak, bu program böbrek dokusu örnekleri içinde diğer lekeler tercüme edilebilir, örneğin, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar ve ANCA ilişkili vaskülit hücre dışı miyeloperoksidaz birikimi için leke. Daha da önemlisi, aynı veriler birden çok kullanıcı tarafından analiz edildiğinde önemli bir fark gözlenmez. Analizin en kritik adımı, Weka Segmentasyon programı için dersleştirici olarak glomeruli ile arka plan, çekirdekve hücre dışı DNA yeterli örnekler sunmaktır.
Bu yöntem kolayca aktarılabilir. Örneğin, hücre ölümü farklı türleri daha fazla analiz apoptoz veya nekroz için belirteçleri karşı belirli antikorlar için boyama yoluyla araştırılabilir. Tekniğimiz otoimmün böbrek hastalığında TLR ekspresyonunun değerlendirilmesi veya insan böbrek biyopsilerinde hücre dışı miyeloperoksidaz ekspresyonu gibi diğer inflamatuar süreçlerde kullanılabilir.
