Glomerulonephritis verursacht pathologische glomeruläre Verletzungen mit erheblichem Zelltod und extrazellulärer DNA-Freisetzung. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung extrazellulärer DNA am Freisetzungsort bei pathologischen Verletzungen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie extrazelluläre DNA aus dem Zelltod in der Niere misst.
Im Gegensatz zu Serum oder Urin ist die extrazelluläre DNA-Messung ein Ersatzmarker für pathologische Schäden. Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sowohl die extrazelluläre DNA-Färbung als auch die Bildanalyse leicht auf andere Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Lupus übertragbar sind. Diese Methode erfordert Grundkenntnisse der Nierenhistologie.
Um den genauen Nachweis von glomerulärer extrazellulärer DNA zu ermöglichen, muss der Forscher in der Lage sein, Glomeruli korrekt zu identifizieren. Für die extrazelluläre DNA-Färbung zunächst die Proben von Interesse in einem Dia-Rack in 60 Grad Celsius für 60 Minuten erhitzen, bevor die Dias in zwei 40-minütige Lösungsmittelwechsel in einer Dunstabzugshaube eingetaucht werden. Nach dem zweiten Eintauchen die Proben zweimal in 100% Ethanol und einmal in 70% Ethanol für fünf Minuten pro Behandlung rehydrieren.
Nach der letzten Behandlung verwenden Sie Zange, um die Dias in kochende Antigen-Retrieval-Lösung in einem Schnellkochtopf auf hoch für 10 Minuten zu platzieren. Nach dem Entlarven der Antigen-Epitope den Schnellkochtopf von der Hitze in ein Waschbecken geben und sofort kaltes Leitungswasser über den Deckel laufen lassen. Lassen Sie die Dias für 20 Minuten in der Antigen-Retrieval-Lösung ausdemieren, bevor Sie die Proben zweimal in 0,01 Molar PBS auf einem Orbital-Shaker für fünf Minuten pro Wäsche waschen.
Nach der zweiten Wäsche verwenden Sie einen hydrophoben Pen, um Kreise um die Nierengewebeproben zu ziehen und jede unspezifische Färbung mit 60 Mikrolitern 10% Hühnerserum in 5% Rinderserumalbumin für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu blockieren. Am Ende der Inkubation die Blockierlösung vorsichtig durch 60 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht bei vier Grad Celsius ersetzen. Am nächsten Morgen waschen Sie die Dias auf einem Orbital-Shaker in PBS für zwei Minuten pro Wäsche, bevor Sie 60 Mikroliter eines geeigneten fluorophorkonjugierten Sekundärantikörpers zu jedem Dia für eine 40-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.
Waschen Sie am Ende der Inkubation die Dias in PBS, wie gezeigt, gefolgt von einer Behandlung in 0,3% Sudan schwarz in 70% Ethanol, um mögliche formalininduzierte Autofluoreszenz zu löschen. Waschen Sie nach 30 Minuten die Rutschen in Leitungswasser, um alle Ausscheidungen zu entfernen, und tauchen Sie die Dias 10 Minuten lang in PBS ein, um eine weitere sudanesische schwarze Niederschlagsbildung zu verhindern. Am Ende der Inkubation die Dias auf konfokale Glasabdeckungen mit drei 60-Mikroliter-Tropfen Montagelösung, ergänzt mit DAPI, montieren und die Abdeckungen mit Nagellack versiegeln.
Lassen Sie die Dias 24 Stunden bei Raumtemperatur aushärten. Bewahren Sie sie bei vier Grad Celsius vor Licht bis zur Bildgebung durch konfokale Laserscanmikroskopie nach Standardprotokollen auf. Versiegeln Sie die Abdeckungen mit Nagellack, um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern und die Abdeckungen von Ethanol zu reinigen, um die bildgebende Auflösung zu verbessern.
Öffnen Sie nach der Abbildung von 20 Glomeruli pro Folie das trainierbare Weka Segmentation Plugin in ImageJ und lassen Sie das erste Bild auf die ImageJ-Symbolleiste. Klicken Sie auf Bild,- und geteilte Kanäle. Es wird ein Bild mit der primären Antikörperfärbung angezeigt.
Um eine zusammengeführte Datei der einzelnen Bilder zu erstellen, klicken Sie auf Farbe und führen Sie Kanäle zusammen. Es wird ein Popup-Feld angezeigt, in dem sie darum bittet, jedem Kanal eine Farbe zuzuweisen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Composite erstellen, quellbilder beibehalten und auf OK klicken. Ein zusammengeführtes zusammengesetztes Bild wird angezeigt.
Zeichnen Sie die primäre Antikörperfärbung als Leitfaden, ziehen Sie eine Region von Interesse um den glomerulären Büschel. Um eine Gaußsche Unschärfe auf dem einzelnen blauen DAPI-Bild auszuführen, klicken Sie auf Prozess, Filter und Gaußsche Unschärfe. Stellen Sie die Unschärfe auf eins bis zwei fest.
Das Bild wird ein wenig verschwommen, aber die Kerne erscheinen glatt, der Hintergrund wird aufgeweicht. Klicken Sie als Nächstes auf Plugins, Segmentierung und trainierbare Weka-Segmentierung, und verwenden Sie das kostenlose Handwerkzeug, um die intakten Kerne zu verfolgen. Wenn alle Kerne von Interesse hinzugefügt wurden, verwenden Sie das Feld "Hinzufügen Klasse 1", um die Hintergrundbereiche für das Feld Klasse 2 zu kennstrecken.
Klicken Sie auf Neue Klasse erstellen, und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um die DAPI-befleckte extranukleare DNA zu skizzieren. Klicken Sie auf Zugklassifier und erhalten Sie Wahrscheinlichkeit. Schalten Sie die Maus um, um ein Schwarzweißbild aller Komponenten zu erhalten, wobei das Auswahlobjekt weiß hervorgehoben ist.
Um dieses Bild zu duplizieren, klicken Sie auf Bild und Duplikat. Unter Bild, anpassen und Schwellenwert. Verwenden Sie die Maustaste, um den Schwellenwert anzupassen, bis nur die extrazelluläre DNA beobachtet wird.
Klicken Sie nach dem Schwellenwert auf Prozess, Binärdatei und erstellen Sie Binärdateien, und kopieren Sie den zuvor generierten glomerularen Bereich von Interesse. Drücken Sie die Steuertaste E, um Bearbeiten, Auswahlen und Wiederherstellung auszuwählen, um die Auswahl wiederherzustellen. Um nur die extrazellulären DNA-Partikel innerhalb des Glomerulus zu messen, klicken Sie auf Partikel analysieren und OK. Es wird ein Ergebnisblatt mit der Anzahl der Partikel, der Fläche, der durchschnittlichen Pixel und des Prozentsatzes der Glomeruli generiert, die extrazelluläre DNA enthalten.
Um den Klassifier als extrazellulären DNA-Klassifier zu speichern, klicken Sie auf Klassifier speichern und speichern Sie die Daten. Um das Modell erneut auf nachfolgende Bilder anzuwenden, wiederholen Sie die anfängliche Bildverarbeitung, wie gezeigt, bevor Sie den Lastklassifier und die gespeicherte Klassifierdatei auswählen. Das Protokollmenü wird angezeigt und das Modell ausgeführt.
Sobald das Modell ausgeführt wurde, klicken Sie auf Daten laden, und wählen Sie die extracellularDNA.arff aus. Klicken Sie dann auf Ergebnis erstellen. Wenn das resultierende Bild nicht alle Kerne, Hintergründe oder extrazelluläre DNA aufnehmen konnte, klicken Sie auf Klassifikator umschulen, und fügen Sie bei Bedarf weitere Klassifikatoren hinzu.
Hier werden Einkanalbilder gezeigt, die repräsentative DNA- und Beta-Actin-Färbungen zeigen. Durch die Zusammenführung der beiden Bilder kann ein Bereich von Interesse um den glomerulären Bereich gezogen werden, um die extrazelluläre DNA innerhalb der Mausnierenglomeruli mit trainierbarer Weka-Segmentierung zu messen, wie gezeigt. Dieses Modell kann angenommen werden, um extrazelluläre DNA in Nierenbiopsieproben von einem Kontrollpatienten oder Vergleich mit der einer Nierenbiopsie von einem Patienten mit Myeloperoxidase ANCA-assoziierte Vaskulitis zu identifizieren.
Darüber hinaus kann dieses Programm in andere Flecken in Nierengewebeproben übersetzt werden, zum Beispiel, um für neutrophile extrazelluläre Fallen und die Ablagerung von extrazellulärer Myeloperoxidase bei ANCA-assoziierter Vaskulitis zu färben. Wichtig ist, dass keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden, wenn dieselben Daten von mehreren Benutzern analysiert werden. Der kritischste Schritt der Analyse besteht darin, genügend Beispiele für Hintergrund, Kerne und extrazelluläre DNA mit Glomeruli als Klassifikatoren für das Weka Segmentierungsprogramm bereitzustellen, von denen man lernen kann.
Diese Methode ist leicht übertragbar. Beispielsweise kann eine weitere Analyse der verschiedenen Arten des Zelltodes durch Färbung für spezifische Antikörper gegen Marker für Apoptose oder Nekrose untersucht werden. Unsere Technik kann mit anderen entzündlichen Prozessen wie der Beurteilung der TLR-Expression bei autoimmunen Nierenerkrankungen oder der extrazellulären Myeloperoxidase-Expression in menschlichen Nierenbiopsien verwendet werden.
