Glomerulonephritis causa lesão glomerular patológica com considerável morte celular e liberação extracelular de DNA. Este protocolo permite a visualização de DNA extracelular no local da liberação durante a lesão patológica. A vantagem dessa técnica é que ela mede DNA extracelular da morte celular no rim.
Ao contrário do soro ou urina, a medição extracelular do DNA é um marcador substituto para danos patológicos. O significado deste método é que tanto a coloração extracelular do DNA quanto a análise de imagem são facilmente transferíveis para outras doenças autoimunes, como artrite reumatoide e lúpus. Este método requer um conhecimento básico da histologia renal.
Para permitir a detecção precisa do DNA extracelular glomerular, o pesquisador deve ser capaz de identificar corretamente glomeruli. Para coloração extracelular de DNA, primeiro aqueça as amostras de interesse em um rack de slides em 60 graus Celsius por 60 minutos antes de imergir os slides em duas mudanças de 40 minutos de solvente em um capô de fumaça. Após a segunda imersão, reidratar as amostras duas vezes em 100% etanol e uma vez em 70% de etanol por cinco minutos por tratamento.
Após o último tratamento, use pinças para colocar os slides em solução de recuperação de antígeno fervente em uma panela de pressão em alta por 10 minutos. Depois de desmascarar os epítopos de antígeno, transfira a panela de pressão do calor para uma pia e corra imediatamente água fria da torneira sobre a tampa. Deixe os slides equilibrarem por 20 minutos na solução de recuperação de antígenos antes de lavar as amostras duas vezes em PBS molar de 0,01 em um agitador orbital por cinco minutos por lavagem.
Após a segunda lavagem, use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor das amostras de tecido renal e bloquear qualquer coloração inespecífica com 60 microliters de 10% soro de frango em 5% de albumina de soro bovino por 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, substitua cuidadosamente a solução de bloqueio por 60 microliters do anticorpo primário de interesse em uma câmara de umidade durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os slides em um agitador orbital em PBS por dois minutos por lavagem antes de adicionar 60 microliters de um anticorpo secundário conjugado fluoróvo apropriado a cada slide para uma incubação de 40 minutos à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, lave os slides na PBS como demonstrado, seguido de tratamento em 0,3% sudão negro em 70% etanol para saciar qualquer autofluorescência potencialmente induzida por formalina. Após 30 minutos, lave os slides na água da torneira para remover qualquer precipitado e mergulhe os slides na PBS por 10 minutos para evitar qualquer formação de precipitação negra do Sudão. No final da incubação, monte os slides em tampas de vidro confocal com três gotas de 60 microliteres de solução de montagem complementadas com DAPI e sele as tampas com esmalte.
Deixe os slides curarem por 24 horas em temperatura ambiente. Armazene-os a quatro graus Celsius protegidos da luz até a imagem por microscopia de varredura a laser confocal de acordo com os protocolos padrão. Certifique-se de selar as tampas com esmalte para evitar qualquer movimento durante a imagem e limpar as tampas do etanol para melhorar a resolução da imagem.
Depois de fotografar 20 glomeruli por slide, abra o plugin de segmentação Weka capacitável no ImageJ e solte a primeira imagem na barra de ferramentas ImageJ. Clique em imagem, cor e canais divididos. Uma imagem mostrando a mancha primária de anticorpos aparecerá.
Para criar um arquivo mesclado das imagens únicas, clique em canais de cor e mesclagem. Uma caixa pop-up aparecerá pedindo que uma cor seja atribuída a cada canal. Verifique o composto de criação e mantenha as caixas de imagens de origem e clique em OK. Uma imagem composta mesclada aparecerá.
Usando a mancha de anticorpos primário como guia, desenhe uma região de interesse em torno do tufo glomerular. Para executar um desfoque gaussiano na imagem daPI azul única, clique no processo, filtros e desfoque gaussiano. Coloque o borrão em um a dois.
A imagem ficará um pouco embaçada, mas os núcleos parecerão suaves, o fundo será suavizado. Em seguida, clique em plugins, segmentação e segmentação weka treinavel, e use a ferramenta manual livre para rastrear os núcleos intactos. Quando todos os núcleos de interesse tiverem sido adicionados, a caixa adicionar classe um, use a ferramenta de linha para delinear as áreas de fundo para a caixa classe dois.
Clique em criar uma nova classe e use a ferramenta de linha para delinear o DNA extranuclear manchado pelo DAPI. Clique no classificador do trem e obtenha probabilidade. Alterne o mouse para obter uma imagem em preto e branco de todos os componentes com o objeto de seleção destacado em branco.
Para duplicar esta imagem, clique na imagem e duplicar. Sob imagem, ajuste e limiar. Use o botão do mouse para ajustar o limiar até que apenas o DNA extracelular seja observado.
Após o limiar, clique no processo, binário e torne binário e copie a região glomerular gerada anteriormente. Pressione o Shift E de controle de comando para selecionar edição, seleções e restaurar para restaurar a seleção. Para medir apenas as partículas de DNA extracelular dentro do glomerulus, clique em analisar partículas e OK. Uma folha de resultado mostrando o número de partículas, área, pixels médios e porcentagem de glomeruli contendo DNA extracelular será gerada.
Para salvar o classificador como classificador de DNA extracelular, clique em salvar o classificador e salvar os dados. Para reaplicar o modelo às imagens subsequentes, repita o processamento inicial da imagem como demonstrado antes de selecionar o classificador de carga e o arquivo classificador de classificador salvo. O menu de registro aparecerá e executará o modelo.
Uma vez executado o modelo, clique em dados de carga e selecione extracellularDNA.arff. Em seguida, clique em criar resultado. Se a imagem resultante não conseguiu captar todos os núcleos, fundo ou DNA extracelular, clique em classificarr o classificador e adicionar mais classificadores conforme necessário.
Aqui, imagens de um único canal mostrando DNA representativo e coloração de beta actin são mostradas. A fusão das duas imagens permite que uma região de interesse seja desenhada ao redor da área glomerular para medição do DNA extracelular dentro do glomeruli renal do rato usando segmentação weka trainável como demonstrado. Este modelo pode ser adotado para identificar DNA extracelular em amostras de biópsia renal de um paciente de controle ou comparação com a de uma biópsia renal de um paciente com vasculite associada à ANCA.
Além disso, este programa pode ser traduzido para outras manchas dentro de amostras de tecido renal, por exemplo, para colorir para armadilhas extracelulares de neutrófilos e a deposição de mieloxidase extracelular em vasculite associada à ANCA. É importante ressaltar que não são observadas diferenças significativas quando os mesmos dados são analisados por vários usuários. O passo mais crítico da análise é fornecer exemplos suficientes de fundo, núcleos e DNA extracelular com glomeruli como classificadores para o programa de Segmentação Weka aprender.
Este método é facilmente transferível. Por exemplo, uma análise mais aprofundada dos diferentes tipos de morte celular pode ser investigada através da coloração de anticorpos específicos contra marcadores para apoptose ou necrose. Nossa técnica pode ser usada com outros processos inflamatórios, como avaliar a expressão TLR em doença renal autoimune ou expressão de mieloperoxidase extracelular em biópsias renais humanas.
