يسمح هذا البروتوكول بالتصور وتتبع التفاعلات البكتيرية بين الأنواع على مستوى الخلية المفردة بمرور الوقت. هذه التقنيات الميزة الرئيسية هي قابليتها للتطبيق لدراسة التفاعلات البكتيرية، بما في ذلك تتبع الخلايا والتعبير الجيني وتلطيخ القدرة على البقاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل الشروط لدراسة الكائنات الحية المختلفة.
للبدء، وإعداد منصات agarose عن طريق ذوبان 2٪ تذوب أقل agarose في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام نمو البكتيريا في قارورة 50 ملليلتر نظيفة Erlenmeyer. ميكروويف القارورة في فترات قصيرة حتى agarose هو في الحل، ثم ندعه يبرد في حمام الماء 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. محاذاة قطع السيليكون مع فتحة في طبق 35 ملليمتر، ثم الوجه الطبق والاستفادة بخفة من السيليكون قطع مع ملعقة لتأمينه إلى الطبق وإزالة أي فقاعات الهواء.
مرة واحدة وقد تبريد agarose، ماصة 915 ميكرولترات من agarose المنصهر في القالب والسماح للوسادة الجافة. قم بتسخين غرفة المجهر البيئية إلى درجة الحرارة التجريبية قبل ساعتين على الأقل من إعداد التجربة. إعداد مناديل الرطوبة عن طريق المتداول بإحكام حتى مسح خالية من الوبر.
ضع المسح المدلفن داخل طبق بيتري معقمة وأضيف 500 ميكرولترات من الماء المعقم مباشرة إلى المناديل. سخني المناديل، ومنصات وطبق معقمة 35 ملليمتر إلى درجة الحرارة التجريبية من أجل اكويات جميع المواد. مرة واحدة في منصات جافة، ماصة واحدة microliter من ثقافة المشاركة بالتساوي عبر الجزء السفلي من طبق الأغطية الزجاجية قبل الدافئة 35 ملليمتر.
إزالة السيليكون قطع من قالب agarose باستخدام ملاقط العقيمة، إمالة إلى الجانب وزلة ملعقة عازمة قليلا تحت حافة لوحة agarose لإسقاطه على غطاء بيتربيلات العقيمة. نقل لوحة إلى الطبق مع الخلايا البكتيرية الجانب السفلي إلى أسفل عن طريق انزلاق ملعقة زاوية 90 درجة تحت لوحة ووضعها على رأس زلة الغطاء ملقح. استخدام ملعقة لجعل وسادة تدفق ضد زلة الغطاء واضغط بلطف من أي فقاعات الهواء.
إزالة الرطوبة الزائدة من مسح رطبة ووضعها حول حافة الطبق، والتأكد من أنها لا تلمس لوحة. العينة جاهزة الآن للتصوير. قبل الوسادات الملقّح، قم بإعداد المجهر عن طريق إجراء إضاءة اللون لمحاذاة جميع إطارات الصور.
بمجرد أن يكون الطبق الملقح جاهزًا ، شاهد الطبق بهدف 100X وركز على النتائج البكتيرية. انقر على خيار المرحلة في برنامج التصوير وضبط النسبة المئوية للضوء الصمام DIA المنبعثة عن طريق تحديد مصدر الضوء وانزلاق شريط على مقياس النسبة المئوية للضوء. بدلاً من ذلك، أدخل وقت التعرض يدويًا.
حفظ الإعدادات لقناة المرحلة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على قناة المرحلة وتحديد الخيار تعيين المجهر الحالي الإعداد. إذا كان استخدام الفلوريسين، حدد قناة الفلوريسنس ذات الأهمية، وحدد النسبة المئوية للضوء المفلور المنبعث، ثم ضبط وقت التعرض كما هو موضح سابقاً. بدلاً من ذلك، قم بتغيير عمق عرض الأسعار لضبط النطاق الديناميكي عن طريق تحديد أحد الخيارات الأخرى في القائمة المنسدلة.
حفظ الإعدادات لقناة الفلوريسنس عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على قناة الفلوريسنس وتحديد الخيار تعيين إعداد المجهر الحالي. في علامة التبويب س ص، انقر فوق المربع في عمود اسم النقطة لحفظ موضع XY المحدد الذي يهمك. ثم انقر فوق المربع PFS في الجزء السفلي من علامة التبويب لتشغيل نظام التركيز المثالي.
التركيز الخلايا ثم انقر فوق السهم في العمود PFS لحفظ التركيز على موضع XY. كرر هذه العملية لكافة مواضع XY الأخرى. حفظ الإعدادات لمواقف س ص تحت علامة تبويب المرحلة كما هو موضح سابقا.
انقر فوق علامة التبويب الوقت وحدد المربع لتحديد فترة الاكتساب، والتردد، ومدة التصوير. ثم انقر فوق علامة التبويب طول الموجة وحدد المربع لتحديد القنوات التي سيتم استخدامها في التصوير وتردد الفاصل الزمني للقناة. عندما الصيد مع الإعدادات، انقر فوق تشغيل الآن لبدء التصوير الفاصل الزمني.
قارن إلى خلايا P.aeruginosa في أحادية الثقافة التي لا تزال مجمعة في الطوافات عندما في الثقافة المشتركة مع S.aureus، P.aeruginosa زادت حركة خلية واحدة نحو مستعمرات S.aureus. P.aeruginosa الخلايا الفردية سوف تحيط وتغزو في نهاية المطاف مستعمرات S.aureus. الكثير من الرطوبة أو القليل جدا أثناء التجربة ومنصات المجففة بشكل غير صحيح هما مشكلتان شائعتان تؤديان إلى الانجراف بسبب تحول الوسادة وسحب الخلايا من مجال الرؤية.
يمكن أن يتسبب تبييض الصور وسمية الصورة في الخلايا أولاً ، أو تفقد الفلورسنس ثم تتوقف عن الانقسام وتموت في نهاية المطاف في إطارات لاحقة. قد لا يكون لدى الخلايا القريبة في البداية من مكان قريب من بعضها البعض ما يكفي من الوقت لوضع تدرج في الإشارات المفرزة التي يمكن للأنواع الأخرى أن تستجيب لها. يمكن تصور صلاحية الخلية البكتيرية عن طريق إضافة يوديد بروبديسيوم إلى منصات agarose.
تشير الخلايا الخضراء إلى الخلايا الحية التي تعبر بنشاط عن GFP ، في حين تشير الخلايا الحمراء إلى الخلايا الملونة الميتة بروبدييوم يوديد بعد معالجتها بخلوة P.aeruginosa الحرة. يتم تتبع حركة خلايا P.aeruginosa الفردية من الإطار الذي يترك خلية الطوافة من خلال الإطار الذي تصل الخلايا فيه إلى مجموعة S.aureus. المسافة بين طوف P.aeruginosa وS.aureus الكتلة، توفر المسافة الإقليدية، في حين أن أطوال المسار الإجمالي توفر المسافة المتراكمة.
يتم حساب توجيه كل خلية كنسبة من المسافة الإقليدية إلى المسافة المتراكمة. البرية نوع P.aeruginosa يتحرك نحو نوع البرية S.aureus مع توجيه أعلى بكثير من نحو S.Aureus تفتقر إلى العوامل المفرزة agr-المنظمة التي هي ضرورية حركية الاتجاه. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن كل محقق سوف تحتاج إلى تحسين الظروف لتجفيف منصات agarose في التصوير الحي على أساس الموقع الجغرافي، والبيئة المختبرية والتجربة الخاصة بهم.
تكشف هذه التقنية عن التفاعلات بين Pseudomonas aeruginosa وAureus العنقودية ، التي تم حجبها سابقًا أثناء تحقيقاتنا في سلوكهم في ثقافة السائبة ، مما يقربنا من فهم كيفية تفاعل هذه الكائنات أثناء العدوى.
