Этот протокол позволяет визуализировать и отслеживать межвидовые бактериальные взаимодействия на уровне одной клетки с течением времени. Основным преимуществом этой техники является ее применимость к изучению бактериальных взаимодействий, включая отслеживание клеток, экспрессию генов и окрашивание жизнеспособности. Кроме того, условия могут быть изменены для изучения различных организмов.
Для начала приготовьте агарозные прокладки путем плавления 2%low melt agarose в 10 миллилитров бактериальных средств роста в чистой 50-миллилитровой колбе Erlenmeyer. Микроволновая печь колбу в короткие промежутки времени, пока агароза находится в растворе, а затем дайте ему остыть в 50 градусов по Цельсию водяной бане, по крайней мере 15 минут. Выровнять кремний вырезать с отверстием в 35 миллиметров блюдо, затем перевернуть блюдо и слегка нажмите кремния вырезать шпателем, чтобы обеспечить его блюдо и удалить любые пузырьки воздуха.
После того, как агароза остынет, пипетка 915 микролитров расплавленной агарозы в форму и дайте площадку высохнуть. Разогреть микроскоп экологической камеры до экспериментальной температуры по крайней мере за два часа до создания эксперимента. Подготовка влажности салфетки, плотно свертывая ворсинки без салфетки.
Поместите свернутую салфетку в стерильную чашку Петри и добавьте 500 микролитров стерильной воды непосредственно в салфетки. Разогреть салфетки, прокладки и стерильное 35-миллиметровое блюдо до экспериментальной температуры, чтобы уравногреть все материалы. После того, как колодки сухие, пипетка один микролитер со-культуры равномерно по всему дну предварительно разогретой стерильной 35-миллиметровой стеклянной крышкой блюдо.
Удалите силикон, вырезать из агарозной формы с помощью стерильных пинцетов, наклонить его в сторону и скольжения слегка изогнутый шпатель под краем агарозы площадку, чтобы бросить его на стерильные петриплаты крышкой. Передача площадку к блюду с бактериальными клетками нижней стороне вниз, сдвинув 90 градусов угловой шпатель под площадку и поместив его на верхней части привитой крышкой скольжения. Используйте шпатель, чтобы сделать площадку флеш против крышки скольжения и осторожно выжимать любые пузырьки воздуха.
Удалите излишки влаги из влажной салфетки и поместите его по краю блюда, убедившись, что он не касается колодки. Образец готов к визуализации. Перед прививкой колодки, настроить микроскоп, выполняя цветовое освещение, чтобы выровнять все рамки изображения.
Как только привитое блюдо будет готово, просмотрите блюдо с целью 100X и сосредоточьтесь на бактериальных результатах. Нажмите на опцию фазы в программном обеспечении изображения и отрегулируйте процент DIA светодиодный свет, излучаемый путем выбора источника света и скольжения бар по шкале светового процента. Кроме того, вручную введите время экспозиции.
Сохраните настройки для фазового канала, нажав правой кнопкой мыши на фазовом канале и выбрав параметр Настройки текущего микроскопа. При использовании флуоресценции выберите канал флуоресценции, представляющий интерес, и установите процент излучаемого света флуоресценции, а затем отрегулируйте время экспозиции, как описано ранее. Кроме того, измените глубину ставки, чтобы настроить динамический диапазон, выбрав один из других вариантов в меню падения вниз.
Сохраните настройки для канала флуоресценции, нажав правой кнопкой мыши на канале флуоресценции и выбрав параметр Настройки текущего микроскопа. Во вкладке XY щелкните поле в столбце имени точки, чтобы сохранить выбранную позицию XY, представляющие интерес. Затем нажмите на поле PFS в нижней части вкладки, чтобы включить идеальную систему фокусировки.
Сосредоточьте ячейки и нажмите стрелку в столбце PFS, чтобы сохранить фокус положения XY. Повторите этот процесс для всех других позиций XY. Сохраните настройки для позиций XY под вкладкой фазы, как это было продемонстрировано ранее.
Нажмите на вкладку времени и проверьте коробку, чтобы выбрать интервал приобретения, частоту и продолжительность изображения. Затем нажмите на вкладку длины волны и проверьте поле, чтобы выбрать каналы, которые будут использоваться в изображении и частоте интервалов канала. При ловлении с настройками, нажмите Run Now, чтобы инициировать промежуток времени изображения.
Сравните с клетками P.aeruginosa в монокультуре, которые остаются сгруппированными в плоты, когда в совместной культуре с S.aureus, P.aeruginosa увеличила подвижность одноклеточных к колониям S.aureus. Одиночные клетки P.aeruginosa будут окружать и в конечном итоге вторгаться в колонии S.aureus. Слишком много или слишком мало влажности во время эксперимента и неправильно высушенные прокладки являются двумя общими проблемами, которые приводят к дрейфу из-за смещения колодки и перетаскивания ячеек из поля зрения.
Фото отбеливания и фото токсичности может привести к клеткам во-первых, потерять их флуоресценции затем остановить деление и в конечном итоге умирают в последующих кадрах. Клетки, которые изначально находятся слишком близко в непосредственной близости, могут не иметь достаточно времени для установления градиента секретных сигналов, на которые другие виды могут реагировать. Бактериальная жизнеспособность клеток может быть визуализирована путем добавления йодида пропидия в агарозные прокладки.
Зеленые клетки указывают на живые клетки, активно выражаюющие GFP, в то время как красные клетки указывают на мертвые иодид пропидия окрашенных клеток после лечения с P.aeruginosa клетки бесплатно супернатант. Движение отдельных клеток P.aeruginosa отслеживается из кадра, в котором клетка покидает плот через раму, в которой клетки достигают кластера S.aureus. Расстояние между плотом P.aeruginosa и кластером S.aureus обеспечивает евклидовое расстояние, в то время как общая длина трассы обеспечивает накопленное расстояние.
Направленность каждой ячейки рассчитывается как отношение эвклидового расстояния к накопленной дистанции. Дикий тип P.aeruginosa движется в сторону дикого типа S.aureus со значительно более высокой направленностью, чем к S.Aureus, не имея регулируемых агр-секретных факторов, которые необходимы для направленной подвижности. При попытке этого протокола, важно иметь в виду, что каждый исследователь должен будет оптимизировать условия для сушки агарозы колодки в живой визуализации на основе географического положения, лабораторной среды и их конкретного эксперимента.
Этот метод выявить взаимодействия между Pseudomonas aeruginosa и золотистый стафилококк, ранее скрыты во время наших исследований их поведения в массовой культуры, что приближает нас к пониманию того, как эти организмы взаимодействуют во время инфекций.
