Este protocolo permite a visualização e o rastreamento de interespécies interespécies bacterianas ao nível de célula única ao longo do tempo. Esta principal vantagem técnica é sua aplicabilidade ao estudo de interações bacterianas, incluindo rastreamento celular, expressão genética e coloração de viabilidade. Além disso, as condições podem ser modificadas para estudar diferentes organismos.
Para começar, prepare as almofadas de agarose derretendo 2% de baixa ágarose de derretimento em 10 mililitros de mídia de crescimento bacteriano em um frasco limpo de 50 mililitros Erlenmeyer. Micro-ondas o frasco em intervalos curtos até que a agarose esteja em solução, em seguida, deixe esfriar em um banho de água de 50 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Alinhe um silício cortado com a abertura em um prato de 35 milímetros, em seguida, vire o prato e bata levemente o silício cortado com uma espátula para fixá-lo ao prato e remover quaisquer bolhas de ar.
Uma vez que a agarose tenha esfriado, pipetas 915 microliters de agarose derretida surgiram no molde e deixaram a almofada secar. Aqueça a câmara ambiental do microscópio à temperatura experimental pelo menos duas horas antes de configurar o experimento. Prepare os limpadores de umidade enrolando firmemente um lenço sem fiapos.
Coloque o lenço enrolado dentro de uma placa de Petri estéril e adicione 500 microliters de água estéril diretamente aos lenços umedecidos. Aqueça os lenços, almofadas e um prato estéril de 35 milímetros até a temperatura experimental, a fim de equilibrar todos os materiais. Uma vez que as almofadas estejam secas, pipeta um microliter de co-cultura uniformemente através do fundo de um prato de deslizamento de vidro estéril pré-aquecido de 35 milímetros.
Remova o silicone cortado do molde de agarose usando pinças estéreis, incline-o para o lado e deslize uma espátula ligeiramente dobrada sob a borda da almofada de agarose para soltá-la sobre uma tampa estéril de petripto. Transfira a almofada para o prato com as células bacterianas do lado inferior para baixo deslizando uma espátula angular de 90 graus sob a almofada e colocando-a em cima do deslizamento de cobertura inoculada. Use a espátula para fazer a almofada escorrer contra o deslizamento da tampa e pressione suavemente todas as bolhas de ar.
Retire o excesso de umidade do lenço úmido e coloque-o ao redor da borda do prato, certificando-se de que ele não toque na almofada. A amostra está pronta para a imagem. Antes de almofadas inoculadas, configure o microscópio realizando iluminação de cores para alinhar todos os quadros de imagem.
Uma vez que o prato inoculado esteja pronto, veja o prato com o objetivo 100X e foque nos resultados bacterianos. Clique na opção de fase no software de imagem e ajuste a porcentagem de luz LED DIA emitida selecionando a fonte de luz e deslizando a barra na escala percentual de luz. Alternativamente, digite manualmente um tempo de exposição.
Salve as configurações para o canal de fase clicando com o botão direito do mouse no canal de fase e selecionando a opção Atribuir configuração de microscópio atual. Se usar fluorescência, selecione o canal de fluorescência de interesse e defina a porcentagem de luz de fluorescência emitida, em seguida, ajuste o tempo de exposição como descrito anteriormente. Alternativamente, altere a profundidade de lance para ajustar o intervalo dinâmico selecionando uma das outras opções no menu suspenso.
Salve as configurações do canal de fluorescência clicando com o botão direito do mouse no canal fluorescência e selecionando a opção Atribuir configuração de microscópio atual. Na guia XY, clique na caixa na coluna nome de ponto para salvar a posição de interesse XY selecionada. Em seguida, clique na caixa PFS na parte inferior da guia para ativar o sistema de foco perfeito.
Concentre as células e clique na seta na coluna PFS para salvar o foco da posição XY. Repita este processo para todas as outras posições XY. Salve as configurações para as posições XY sob a guia de fase como demonstrado anteriormente.
Clique na guia de tempo e marque a caixa para selecionar o intervalo de aquisição, frequência e duração da imagem. Em seguida, clique na guia comprimento de onda e marque a caixa para selecionar canais a serem usados na frequência de imagem e intervalo do canal. Quando pescado com as configurações, clique em Executar Agora para iniciar a imagem de lapso de tempo.
Compare com as células P.aeruginosa na monocultura que permanecem agrupadas em jangadas quando em co-cultura com S.aureus, P.aeruginosa aumentou a motilidade celular única em relação às colônias de S.aureus. P.aeruginosa células únicas cercarão e eventualmente invadirão colônias S.aureus. Muita ou pouca umidade durante o experimento e almofadas secas incorretamente são dois problemas comuns que levam à deriva devido à mudança da almofada e arrastando as células para fora do campo de visão.
O branqueamento de fotos e a toxicidade da foto podem fazer com que as células primeiro, soltem sua fluorescência, em seguida, parem de se dividir e eventualmente morram em quadros subsequentes. Células inicialmente muito próximas podem não ter tempo suficiente para estabelecer um gradiente de sinais secretos aos quais outras espécies podem responder. A viabilidade celular bacteriana pode ser visualizada adicionando iodeto de propidium às almofadas agarose.
As células verdes indicam células vivas expressando ativamente o GFP, enquanto as células vermelhas indicam células manchadas de iodeto de propídio morto após serem tratadas com supernanato livre de células P.aeruginosa. O movimento das células P.aeruginosa individuais são rastreados a partir do quadro em que uma célula deixa a jangada através da estrutura em que as células atingem o aglomerado S.aureus. A distância entre a jangada P.aeruginosa e o aglomerado S.aureus, proporciona a distância euclidiana, enquanto os comprimentos totais da pista proporcionam a distância acumulada.
A direção de cada célula é calculada como uma razão da distância euclidiana à distância acumulada. Tipo selvagem P.aeruginosa move-se em direção ao tipo selvagem S.aureus com direção significativamente maior do que em direção a S.Aureus sem fatores secretos regulamentados agr que são necessários para a motilidade direcional. Ao tentar este protocolo, é importante ter em mente que cada investigador precisará otimizar as condições para a secagem de almofadas agarose em imagens ao vivo baseadas na localização geográfica, ambiente de laboratório e seu experimento particular.
Esta técnica revela interações entre Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, anteriormente obscurecida durante nossas investigações de seu comportamento na cultura a granel, nos aproximando de entender como esses organismos interagem durante as infecções.
